大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化.doc

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
一可溶性蛋白的纯化
（一）菌体的破碎
1.仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mMPBS或50mMTris-HClpH7.5；50ml离心管；冷冻高速离心机
2.方法
2.1反复冻融
2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4℃离心15min，弃上清。
2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mMPBS或50mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml,EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)
2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：
（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
二包涵体蛋白的纯化
1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）
1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mMPBS或20mMTris-HClpH7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml，15ml离心管；冷冻离心机
1.2方法
(1)收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4℃离心15min，弃上清。
（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mMPBS或20mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。
（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml-10ml裂解液)
（4）每毫升悬液中加入100ul10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min
（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。
（6）4℃，4000rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。

注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.
2包涵体的洗涤
(1)将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的BufferA中，每克湿重加4-6ml洗涤液。
(2)超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。
(3)4℃，4000rpm/min离心15分钟。
(4)重复上述操作2次至上清液透明无色。
(5)将包涵体沉淀重悬于BufferA，4℃，4000rpm/min离心15分钟，弃掉上清。
BufferA50mMTris-HClpH8,0.2mMEDTA,100mMNaCl,1%Tritonx-100（或2%脱氧胆酸钠）1mMDTT1mMPMSF溶菌酶10mg/ml
注意事项：
(1)包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。
(2)经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。
(3)包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。
(4)用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：
(1)菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的BufferA中，4℃涡旋悬液30min，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。
(2)取一小部分上清用BufferA稀释到盐酸胍浓度为4M，然后4℃涡旋悬液15min，