重组蛋白纯化的基本策略.doc

重组蛋白纯化的基本策略作者：佚名实验频道来源：本站原创点击数：1241更新时间：2004-12-21及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

分离方法的选择
根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：
蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）

每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。

在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：
技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率
高容量
高速度★★★★★★★★★低离子强度
样品体积不限高离子强度或pH改变。
样品浓缩HIC分辨率好
容量好
高速度★★★★★★高离子强度
样品体积不限低离子强度
样品浓缩AC高分辨率
高容量
高速度★★★★★★★★结合条件特殊
样品体积不限洗脱条件特殊
样品浓缩GF高分辨率
（使用Supedex）★★★★样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）
样品稀释RPC高分辨率★★★★需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险

提示：
1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法
5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。

注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。
附：纯化工艺路线