高效液相色谱柱.doc

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固定化金属离子亲和色谱用于蛋白质及肽的分离分析

摘要：固定化金属离子亲和HYPERLINK"javascript:;"\t"_self"色谱（IMAC）作为一种新型高效色谱分离模式，已经被广泛应用于HYPERLINK"javascript:;"\t"_self"蛋白质的分离分析。IMAC常作为捕获/释放柱，富集某一类肽段或蛋白质，以及含有组氨酸标签的重组蛋白的分离纯化。由于IMAC材料对于样品的分析能力相对较弱，经过IMAC柱分级后的组分仍然十分复杂，因此，通常需要对这些组分进行进一步分离。针对这一问题，本文发展了一种可重复使用的高效IMAC柱，并将其用于（一维及二维）高效HYPERLINK"javascript:;"\t"_self"液相色谱的分离。
AnalyticalSeparationsofProteinsandPeptidesUsingImmobilizedMetalAffinityChromatography
PatrickMcCarthy,MarkTracy,TerrySheehan,andChristopherPohl
Abstract：Immobilizedmetalaffinitychromatography(IMAC)isawell-establishedproteinseparationtechniqueexperiencingexpandedusebasedonnew,high-performanceanalyticalphases.IMACiscommonlyusedincapture/releasecartridgesforenrichingpeptidesandproteinsofacertainclassorHistaggedrecombinantproteinpurification.Duetotherelativelyhighresolutionofthesecartridges,fractionscollectedfromthecartridgescanstillbequitecomplex,andfurtherpurificationisgenerallyrequired.Toaddressthislimitation,areusable,high-resolutionIMACcolumnthatcanbeusedforhigh-performance(1-Dand2-D)LCseparationshasbeendeveloped.
基于新型、高性能的固定相的固定化金属离子亲和色谱（IMAC）是一种信誉卓著的蛋白质分离技术，近来受到广泛的关注。IMAC常作为捕集柱，用于富集某一特定类型的肽段或蛋白质（如表面含有裸露的组氨酸残基或磷酸化的肽段/蛋白质），以及含有组氨酸标签的重组蛋白的分离纯化。由于IMAC的分离柱效相对较低，经过IMAC柱分级收集的组分仍然相当复杂，通常需要对其做进一步纯化处理。针对这一问题，本文发展了一种可重复使用的高效IMAC柱，并将其应用于（一维和二维）液相色谱的分离分析。
在本文中所设计的ProPac®IMAC-10（DionexCorp.,Sunnyvale,CA）固定相能够使蛋白质分子与固定相表面的HYPERLINK"javascript:;"\t"_self"纳米粒子产生一对一的相互作用。通过这种方式，可以将预富集的蛋白与基质中的其他组分（如蛋白质、肽段、DNA等）分离，同时也与相邻的纳米粒子所结合的组分分离。从概念上讲，这种设计非常适于某一类蛋白质或肽的分离，柱上复性、柱上蛋白质与蛋白质的相互作用研究以及柱上定位反应（如定位生物素标记）。本文举例说明了ProPacIMAC-10对蛋白质及肽的分离能力。
1实验部分
1.1试剂与材料
实验所使用的试剂包括：氯化钠（Fluka,Milwaukee，WI）；咪唑（Fluka）；尿素（Sigma,St.Louis,MO）；乙腈（Burdick&Jackson,MorrisTownship,NJ）；去离子水，阻抗18MΩ?cm；三氟乙酸（TFA）（PierceChemical,Rockford,IL）；十水合焦磷酸四钠（TSPP），Na4P2O7-10H2O（Sigma）；甲酸，98%（EMScience,Gibbstown,NJ）；冰乙酸（J.T.Baker,Phillipsburg,N