聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

聚丙烯酰胺凝胶电泳法
1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。(2)溶液B取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。(3)电极缓冲液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。(7)脱色液7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm,然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。(4)染色和脱色电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡10～30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。(5)结果判断将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。相对迁移率供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R'<[m]>)进行比较。
实验二、血清蛋白的分离
——聚丙烯酰胺凝胶电泳法
目的要求
(1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（verticalslab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，以冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。
试剂和器材
一、试剂
分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris6g,甘氨酸28.8g,用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。
30％Acr－Bis贮存液：30gAcr,0.8gBis,用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
TEMED；10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。
染色液：称取考马斯亮蓝R2502.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454ml使其完全溶解，过滤后置棕色瓶保存。
脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。
二、材料
人或动物血清。
三.器材
DYCZ-24D型垂直板电泳槽；移液管1mL（′3），5m