western实验步骤.docx

westernbolt实验操作步骤
中心实验室内部文件
WESTERNBLOT操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳

灌胶：注意：Acrylamide（聚丙烯酰胺）剧毒，需戴手套操作。
1、将玻璃板用清洗剂洗干净后，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗三遍（勿用酸泡）。
2、固定好玻璃板，配置分离胶溶液(10ml两板，一板可以减半配制)根据分子量选择相应浓度的分离胶。
胶浓度超纯水凝胶
储备液Gelbuffer
※PH8.810%
SDS10%
APSTEMED10%
常用4.1ml3.3ml2.5ml0.1ml50µl15µl12%
小分子量3.4ml4.0ml2.5ml0.1ml50µl15µl8%
大分子量4.7ml2.7ml2.5ml0.1ml50µl15µl3、用1000µl移液器吸取分离胶溶液，缓缓灌入夹缝中，勿产生气泡，每板大约4.5ml，灌完后再胶顶部加无水乙醇封闭。
4、待分离胶凝固（约40min）倒掉无水乙醇，用超纯水清洗三次，用滤纸洗掉多余水分。
5、配制浓缩胶溶液（10ml-四板量，两板可减半配置）。
胶浓度超纯水凝胶
储备液Gelbuffer
※PH8.810%
SDS10%
APSTEMED5%5.7ml1.7ml2.5ml0.1ml50µl20µl6、灌浓缩胶，并插梳子。
7、室温聚合30-45min，将玻璃板固定于电泳槽内，倒入适量的1×电泳缓冲液，拔出梳子。
上样，电泳
上样：20µl移液器逐个加样，（第一道加5×RSB小于4µl和Matker4µl,空泳道加5×RSB5µl）。加适量1×电泳缓冲液，接好正负电极。开始设置为90V恒压，观察marker的移动情况，尽量拉长自己感兴趣的区域，适时终止电泳。
转膜。

电泳：1、将建勇后的胶取出浸入转膜液，（注意胶方向，做好标记）摇床缓慢摇30min。戴手套裁取PVDF膜(8.3×5.2cm)，甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入转膜液中，至少5min。将取下胶的玻璃板清洗干净
2、用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极版上，将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡。
3、润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。
4、盖上顶层电极板、接通正负极电源，15V(不超过25V)转印20min。
5、配封闭液。

杂交
取出PVDF膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇1hr以上。
倒掉封闭液，用洗膜液略洗一下，取15ml离心管，加入5ml杂交液。按适当比例稀释一抗(按说明书要求)，管上注明抗体名称、来源、分子量和稀释比例。摇床上室温杂交2hr或4°C杂交过夜。
取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。
倒掉TBST，把PVDF膜放入装有二抗的15ml离心管中，摇床上杂交1hr。
取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。

ECL反应
倒掉洗膜液，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。
将ECL试剂盒内的detectionreagent1与detectionreagent2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1-2min。
上机检测。
注意事项
大部分试剂有累积毒性，必须佩戴手套操作。
玻璃板贵且易碎，使用时轻拿轻放，用完刷干净放于板架上。
移液器使用完调至最大量程放在枪架上。
梳子使用完拿水冲净。
制胶架上的胶条，制胶完毕后需用水冲净擦干，用完放回原位。
半干转印仪使用完需拿纸擦干电极板。
实验完毕，实验台收拾干净，废液缸倒净，关闭仪器电源。
试验方法（样品篇）
样品制备
BCA法测定蛋白质浓度
BCA蛋白测定试剂盒（BCAProteinAssayKit）是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。
测定蛋白方法
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂（50：1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
将标准品按0，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品中，加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
加适量体积样品到96孔板的孔中，加稀释标准品的溶液到20微升。
各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
注：也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果温度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
6．测定A562或540-595nm。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
7．根据