western-blot实验步骤.pdf

Westernbolt一、实验目的通过实验了解westernblot技术的原理和操作。二、实验原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。PAGE能有效的分离蛋白质主要依据其分子量和电荷的差异而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）SDS会与变性的多肽并使蛋白带负电荷由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关在达到饱和的状态下每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系符合下式：logMW=K-bX式中：MW为分子量X为迁移率k、b均为常数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图可获得一条标准曲线未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane简称NC膜)在胶体金试纸中用做C/T线的承载体同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合即抗体的抗体其主要作用是检测抗体的存在放大一抗的信号。化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物也常被称为ECL试剂）是目前Westernblot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶）可以催化A液和B液反应发光。三、实验器材1.电泳槽胶板架子2.转膜仪3.NC膜4.电泳电源5.滤纸6.摇床7.X射线摄影暗匣8.X射线胶片9.塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris15.1gGlycine94.0gSDS5.0gddH2O定容至1L使用前稀释5倍2.Transferbuffer10×Transferbuffer(1L)Tris30.3gGlycine144.0gddH2O定容至1L使用前稀释10倍加入1/4体积的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris12.1gNacl40.0gddH2O定容至500mL用HCl调节溶液的pH值至7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)脱脂奶粉2.5gTBST定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.显影液现配现用溶液A：溶液B=1:1配置。9.SDS-PAGE（配方见下一页）五、操作步骤1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1SDS-PAGE胶的配置①先清洗胶板用去离子水冲洗后放在架子上待干。②准备好试剂。③计算所需要使用试剂的量。例：6%的分离胶每块胶板分离胶约需要7ml10块胶共需要70ml④将胶板安装在架子上较低的板朝外注意底部要平以防漏胶。较高的板有正反之分上面的“up”朝上。⑤准备配胶按照上面配方依次添加。注意：1.添加量少的试剂要注意混匀2.TEMEDAPS要最后加⑥配好分离胶将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢否则胶液会凝越是浓度高的胶液凝的越快。⑦分离胶加入后用异丙醇或水封平胶面注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。⑧半小时后