Western blot实验步骤.doc

Westernblot实验步骤
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做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的玻璃板、梳子和制胶架。
2)检查是否有新鲜的、足量10%APS，没有就立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。（一般使用12%和7.5%）
4)提前一天配制好转印缓冲液，4℃预冷过夜
制胶，电泳
1）装置胶架
a．玻璃板凹面朝里，底部对齐至于架子上。
b．按正确方向安上楔子，先不压紧。
c．将两侧边扣扣紧。
d．双手同时均匀用力，分别将两侧楔子向下压紧。
e．检查是否密封。
2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，总量：7.5ml)
7.5％10％12%15%H2O7.5ml6ml5ml3.5ml1.5MTris-HCL(pH=8.8)3.75ml3.75ml3.75ml3.75ml10%SDS150μl150μl150μl150μl10%APS75μl75μl75μl75μlTEMED7.5μl7.5μl7.5μl7.5μl30%Acry/bis3.75ml5ml6ml7.5ml分离蛋白大小（kD）36-9420-8012-6010-43在分离胶上缓慢加入一层蒸馏水（约1ml），压平分离胶，并促进胶更好的凝固。
3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，总量：5ml)
4％H2O3.6ml1MTris-HCL(pH=6.8)600μl10%SDS50μl10%APS25μlTEMED5μl30%Acry/bis670μl浓缩胶加完后迅速插入预先准备好的梳子，室温待其凝固。
4)制备蛋白样。
5×上样缓冲液与样品混合，使上样缓冲液达到1倍浓度，100℃金属浴或隔水煮8-10min，10000r/min离心5min
5)待胶凝固好后，放入电泳槽中，加入电泳缓冲液没过凝胶，
6）垂直拔去梳子，上样，电泳。浓缩胶使用140V电压，约20-30min样品电泳至交界面，调电压至110V，继续电泳约1.5h。

3、考马氏亮蓝染胶
1）铲下弃去浓缩胶，小心剥下分离胶置于大平皿，倒入考马氏亮蓝染色液（覆盖胶即可）
2）摇床染色50min
3）回收考马氏亮蓝染色液，脱色液摇床脱色30min
4）弃去脱色液，用新鲜脱色液摇床脱色30min（可根据情况增加脱色次数）
注意：考染和转印应为不同的两块胶。

电转移（转印）
1实验条件的选择
本电泳仪自动默认转印电流为200mA。按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，一般转印时间为100min，具体可以根据实际适当调整。
目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度电转移时间(h)80---1408%1.5-2.025---8010%1.515--4012%0.75<2015%0.52实验操作
（1）滤纸和膜的准备(提前准备)。
检查是否有合适大小的滤纸和膜。
将合适的靠胶滤纸、靠膜滤纸、NC膜、海绵分别泡入转印缓冲液中，4℃过夜。
（2）转移
在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用3层。
将胶剥出，去掉浓缩胶，小心的移到靠胶滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡。
将膜铺在胶上，注意和胶间不要有气泡，再倒少许转印缓冲液到膜上，保持膜的湿润。剪去膜的左上角，作为标记。
将一张靠膜滤纸覆盖在胶上。倒上些转印缓冲液，再铺3层靠膜滤纸。
按照负极-海绵-靠胶滤纸-胶-膜-靠膜滤纸-海绵-正极的顺序放入电泳槽。（NC膜≥滤纸≥胶）
装好电转移仪，将电泳槽置于盛满冰的冰桶中，确保电泳槽全部被冰覆盖。
转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整（电压一般30-40V,功率6-8W）。
（3）丽春红染膜
A．500μl丽春红+4.5ml蒸馏水配制染色液
B将膜浸泡其中，作用1-2min可见条带。
C用铅笔标出泳道和maker条带大小。
DPBS洗去丽春红染液。
抗原抗体反应
1、封闭
在转移结束前配好5%的脱脂牛奶(TBST溶解)。转移结束后将膜放入脱脂奶中封闭(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，4℃封闭过夜或者室温封闭2h-4h。
3、洗膜
用TBST先快速洗涤，5min×2。
2、孵育一抗
先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。配制5%的脱脂奶(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。
将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用4℃过夜或者室温1-2h，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。
3、洗膜
用TBST先快速洗涤，把脱脂奶尽快的洗掉。然后5min×5。
洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。
4、孵育二抗
室温孵育1h。采用HRP标记的二抗，稀释比例1:5000-10000
二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗。
5、洗