实时荧光定量PCR技术.doc

简述实时荧光定量PCR技术
1.实时荧光定量PCR技术的原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。
荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。
定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。
实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

图1实时荧光定量PCR的标准扩增曲线
荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。Ct值也称阈值循环(thresholdcycle)，指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
简单地说，实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
2.实时荧光定量PCR技术的类型及特点
实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。
2.1SYBRGreenI检测
SYBRGreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料，它只有与dsDNA结合后才会发出荧光。在变性时，DNA双链分开，不产生荧光；在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBRGreenI发出荧光。荧光强度逐渐增强，直到达到阈值，被荧光探测系统检测到[4]。因此，荧光强度可以代表扩增产物的数量。SYBRGreenI的优点在于：①成本较低，不需合成和标记探针；②适合初步筛查：选用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品。但其缺点有：①特异性差，不能分辨主带与杂带，给出的是总信号，所以在低样本浓度时，不能进行基因突变分析。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体和非特异性产物区别开来，不需要通过电泳鉴定；②不能做多重检测，每孔只能检测1个目标基因；③灵敏度低，适合于5000拷贝以上的基因定量。
2.2TaqMan探针
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

图2常规TaqMan探针检测原理
常规TaqMan探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四