蛋白质印迹Western-blot实验方案.doc

蛋白质印迹（Westernblot）实验方案
溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在4℃下保存数周，或者以分装形式在-20℃下保存长达1年。
Nonidet-P40(NP40)缓冲液
150mMNaCl1.0%NP40（可用0.1%TritonX-100替代）50mMTris-HClpH8.0蛋白酶抑制剂
RIPA缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）
150mMNaCl1.0%NP-40或0.1%TritonX-1000.5%脱氧胆酸钠0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）50mMTris-HClpH8.0蛋白酶抑制剂
Tris-HCl缓冲液
20mMTris-HClpH7.5蛋白酶抑制剂
电泳、转膜、封闭缓冲液
Laemmli2×缓冲液/上样缓冲液
4%SDS10%2-巯基乙醇20%甘油0.004%溴酚蓝0.125MTris-HCl
测定pH并调节至pH6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）
25mMTris碱190mM甘氨酸0.1%SDS
测定pH，pH应为约8.3。必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）25mMTris碱190mM甘氨酸20%甲醇
测定pH，pH应为约8.3。必要时进行调节。
对于大于80kDa的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为0.1%的SDS。
转膜缓冲液（半干转）
48mMTris39mM甘氨酸20%甲醇0.04%SDS
封闭缓冲液5%奶粉或BSA（牛血清白蛋白）加入TBST缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。

实验步骤
样品裂解
1.制备细胞培养物裂解物
将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的PBS洗涤细胞。
吸出PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每107细胞/100mm培养皿/150cm2培养瓶加入1ml；每5×106细胞/60mm培养皿/75cm2培养瓶加入0.5ml）。
用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
在4℃下持续搅拌30分钟。
在4℃预冷的离心机中以16,000×g的转速离心20分钟。
轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。

2.制备组织裂解物
用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。
将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5mg的组织，向离心管中快速加入约300μL裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外300μL裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4℃下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2小时。
4℃下在微型离心机中以16,000×g离心20分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。

样品制备
取出小部分(50μL)裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2×Laemmli样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
还原和变性：在100℃下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5分钟，并进行分装。在-20°C下保存裂解物。注意：分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环。
在37℃下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以16,000×g离心5分钟。

上样和电泳
将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
在100V下电泳1至2小时。
可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。
凝胶百分比取决于蛋白质的大小：
4-40kDa20%12-45kDa15%10-70kDa12.5%15-100kDa10%25-200kDa8%将蛋白质从凝胶转移到膜上
如下制备转移堆叠体：

膜可以是硝酸纤维素或PVDF，两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF1分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。
所得膜可用于抗体染色。

抗体染色
用5%封闭溶液在室温下封闭膜1小时，或在4℃下封闭过夜。
用适当稀释度的一抗在5%或2%封闭溶液中4℃过夜孵育膜，或在室温下孵育2小时。
用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。
用推荐稀释度的标记二抗在含5%封闭缓冲液的TBST中室温孵育膜1小时。
用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，然后用TBS冲洗。
要产生