酶学分析ALT分析Km值.ppt

第四章酶学分析酶(Enzyme)是生物体内具有催化功能的蛋白质，又叫生物催化剂。生物体内的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，因此酶学的研究，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质以及指导有关的医学实践和工农业生产都有重要意义。第一节酶的分离纯化一、酶的分离2．细胞的破碎
常用的细胞破碎方法有：(1)绞碎、匀浆、高速组织捣碎机捣碎等；(2)对于细胞壁较厚的微生物材料，通常采用加石英砂研磨、超声波破碎、反复冻融等方法；(3)对于细胞膜上的酶还可以采用有机溶剂处理、去垢剂处理等。二、酶的纯化1．沉淀法(5)热变性沉淀法：
对于热稳定酶(如酵母醇脱氢酶)，可利用温度控制，将杂蛋白变性沉淀除去。该法提纯效果很好，但在操作时要防止局部过热，一般用比变性温度高l0℃的水浴迅速升温，在变性温度下保持一定时间后，用冰迅速冷却。2．层析法4．结晶第二节酶的活力测定一、酶活力与酶反应速度2．酶反应速度

酶活力测定常采用测反应初速度的方法。底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速度为初速度。底物浓度太低时，5％以下的底物浓度变化不易测准，所以在测酶活力时，往往使底物浓度足够大，这样酶促反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说却是一级反应，由此测得的速度就能较可靠地反映酶的活力。测定酶活力有两种方法：二、测定方法1．化学法

这是一种取样法。终止酶反应通常采用加入酶的变性剂的方法。如果反应底物或产物热稳定性好，也可用加热使酶失活的方法终止酶反应，但时问较难控制。该法工作量大，本身包含一定的误差，对速度快的反应常不易得到十分准确的结果。2．比色法

比色法是根据底物和产物在某～波长上有明显的特征吸收差别建立起来的连续观测方法。3．荧光法

利用酶反应的底物、产物或辅助物具有荧光，通过测荧光强度变化来测酶活力。例如，某些脱氢酶的辅酶NADH(或NADPH)的中性溶液能发出强烈的蓝白色荧光(460nm)，而NAD＋(或NADP＋)则没有。用荧光法测酶活力时，通常以单位时间内荧光强度的变化来表示。
荧光法的优点是灵敏度极高，比分光光度法还要高2～3个数量级，故特别适用于酶量或底物量极低的快速酶分析。其缺点是：荧光读数与浓度之间没有直接的比例关系，而且常因测定条件(如温度、散射、仪器等)的不同而不同。4．电化学法

包括离子选择性电极测定法、氧电极测定法及电流测定法等。5．同位素法

用同位素标记底物，随着酶催化反应的进行，一部分标记的底物将转化为产物。反应终止后，分离底物和产物，测底物的放射性减少量或产物的放射性增加量。常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和131I。同位素法的特点是灵敏度极高，但操作烦琐、费时，有放射性，操作者须特别小心。三、酶的活力单位(U)及比活力1．酶的活力单位

1976年国际酶学生化学会委员会规定：1个酶活力单位，是指在特定条件下，1分钟内能将l微摩尔(μmol)底物转化为产物所需的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
在临床上酶活力单位常用习惯表示法。如对血清谷丙转氨酶(ALT)活力单位按King氏法定义为：每100ml血清在37℃，pH-7.4条件下与底物作用60min，生成1μmo1丙酮酸为1个活力单位。2．酶的比活力

比活力的大小，就是酶含量的大小，即酶蛋白所具有的酶活力，一般用活力单位／毫克蛋白(U／mg蛋白)来表示，有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(单位／克或单位／毫升)。3．酶的转换数

指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数(μmol／s)，它相当于一旦底物一酶(ES)中间复合物形成后，酶将底物转换为产物的效率。第三节酶促反应动力学一、底物浓度对反应速度的影响1．米-曼氏方程式2．Km值和υmax值的测定二、酶浓度对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响四、pH对反应速度的影响五、激活剂对反应速度的影响六、抑制剂对反应速度的影响1．不可逆性抑制作用2．可逆性抑制作用(1)竞争性抑制作用：抑制剂与酶的底物结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。这类抑制作用使酶的Km增大，但不改变酶的υmax。3．反竞争性抑制作用第四节酶法分析酶法分析是指应用酶作为工具的分析方法，可以对酶的底物、辅酶、激活剂或抑制剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析法、终点测定法和酶标免疫测定法。其中终点测定法的应用最为普遍。所谓终点测定法就是借助某种酶的作用，使被测物质定量地进行转变。在转化完成后，测定底物、产物或辅酶等物质的变化量。它可分为单酶反应定量法和偶联酶反应定量法。一、单酶反应定量法(1)测定底物的减少量：在以待测物质为底物的酶反应中，如果底物能接近完全地转比为产物(当有99％转化成产物时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种特征性质(如具有特殊的吸