实验九聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点.ppt

实验九聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点一、目的要求二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
两性电解质载体(carrierampholytes)
(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。
(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。
(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。
(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3三、试剂与器材四、操作方法
1.凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表10mL7.5%凝胶的配制
试剂名称 体积(mL)
凝胶贮液 2.5
两性电解质载体 0.5
10%TEMED 0.1
蛋白质混合样品 0.1
蒸馏水 6.75
混匀后置真空干燥器中抽气10min
10%过硫酸铵 0.05
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3-5mm高。
（4）待凝胶聚合
2.电泳
小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100V，待电压稳定后再升到300V，电泳2h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4.固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。

5.pH梯度的制作
取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已编好号并装有1mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。
6.蛋白质样品等电点的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
固定染色前凝胶条长度
固定染色后凝胶条长度
计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。
五、注意事项
盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。
加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150g；如用银染色，加样量可减少到1g。一般样品浓度以0.5-3mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30l。
六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？