一种天女木兰种子石蜡切片方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN104614211A
(43)申请公布日2015.05.13

(21)申请号CN201510022858.2

(22)申请日2015.01.19

(71)申请人沈阳农业大学
地址110866辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号

(72)发明人陆秀君梅梅孙晓梅张丽杰王玉涛马蓓蓓张晓林

(74)专利代理机构沈阳科威专利代理有限责任公司

代理人张述学

(51)Int.CI
G01N1/28

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称
一种天女木兰种子石蜡切片方法

(57)摘要
一种天女木兰种子石蜡切片方法，

其步骤如下：取材；FAA固定液固定；
65%到100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱
水；无水乙醇到纯二甲苯逐级透明；将低
熔点的石蜡蜡屑放入盛有1/2二甲苯的小
瓶中，直到二甲苯完全饱和，在40℃下浸

蜡24h，然后用由混合石蜡在温箱中60℃
保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，共72-
120h；包埋；进行厚度6-8μm切片；2%明
胶粘片，在35℃水浴锅上2h展片，之后
再将载玻片放入38℃烘箱中烘干；用纯二

甲苯30℃保温脱蜡40min，晾干切片；中
性加拿大树胶封片。本发明能较好的固定
天女木兰种子细胞组织，切片完整，清
晰，易于观察，操作简单。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）取材与固定

种子选取：将去除假种皮的饱满的天女木兰种子用浓度0.2%高锰酸钾溶液消毒

30min，用流水冲洗干净；

样品固定：将洗净的种子用吸水纸吸干种子表面水分，剥去种皮，将种子迅速放入

盛有FAA固定液的小瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24-72h；

（2）脱水：固定的材料依次经过65%→75%→85%→95%→100%→100%系列浓度
的乙醇溶液逐级脱水，每个浓度梯度脱水时间依次
2h→1.5h→1.5h→1h→30min→15min；

（3）透明：经4/5无水乙醇+1/5二甲苯→3/5无水乙醇+2/5二甲苯→2/5无水乙醇
+3/5二甲苯→1/5无水乙醇+4/5二甲苯→纯二甲苯→纯二甲苯，不断增加二甲苯的
体积比例，逐级透明，每级透明时间依次为
1.5h→1.5h→1.5h→1.5h→40min→20min；

（4）浸蜡：将材料透明彻底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将熔点为52-54℃

的石蜡蜡屑放入小瓶中，一直加到二甲苯完全饱和；在40℃下浸蜡24h，之后再用
混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72-120h；混合蜡液
是由熔点为58-60℃和熔点为50-52℃的石蜡按重量比1:1的比例融合而成；

（5）包埋：材料浸蜡结束后马上用镊子轻轻转移到装有液态混合石蜡的小纸盒中，
调整好材料位置，再将小纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，
迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶；

（6）切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成小梯形，然后粘到切片

机的蜡台上进行切片，切片厚度6-8μm；

（7）粘片：在洁净的载玻片上均匀涂薄层质量体积比为2%明胶，将蜡带小心地
放载玻片上，用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片放在

30-35℃水浴锅上2h，使蜡带光面紧贴载玻片；之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘
干；

（8）脱蜡：在染色缸中用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，之后倒掉二甲苯，晾干
切片；

（9）封片：切片从染色缸中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴
中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并
将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

2.根据权利要求1所述的天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于：FAA固定液组
成为：浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1：1：18。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物种子石蜡切片方法，特别涉及一种天女木兰种子种胚石蜡切片
方法。

背景技术

天女木兰（<I>MagnoliasieboldiiK.Koch.</I>）是木兰科的落叶小乔木，是稀有的
观赏植物，为国家三级重点保护植物，也是我国东北地区唯一的野生木兰属植物。

天女木兰种子具有生活力较低，休眠期长，萌发率极低，发育不整齐等特性。大大
限制了天女木兰有性生殖的成功率，从而导致林下天然更新苗严重缺乏。天女木兰
育苗技术复杂，繁殖难度大，特别是用种子繁殖速度非常慢。因此，开展对天女木
兰种子休眠与萌发的研究既具有