一种太白贝母种子石蜡切片方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115307995A(43)申请公布日2022.11.08(21)申请号202210943585.5(22)申请日2022.08.08(71)申请人云南农业大学地址650000云南省昆明市盘龙区金黑公路95号(72)发明人梁艳丽张晓玉杨秋雄张国武韩俊胡于琴赵敏王硕杨和团(74)专利代理机构昆明正原专利商标代理有限公司53100专利代理师陈左(51)Int.Cl.G01N1/28(2006.01)G01N1/30(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称一种太白贝母种子石蜡切片方法(57)摘要本发明涉及植物领域，特别涉及一种太白贝母种子的石蜡切片。本方法采用材料为重庆市巫溪县种植的太白贝母种子，主要步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色、脱水透明、封片、观片等。本发明在取材、脱水、透明、浸蜡等步骤中较常规石蜡切片进行了改良，能够较好的固定太白贝母种子细胞组织，切片完整，清晰，易于观察，操作简单，有利于开展太白贝母种质资源解剖结构的观察和研究，为研究太白贝母种子打破休眠的分子机制提供基础。CN115307995ACN115307995A权利要求书1/1页1.一种太白贝母种子石蜡切片方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）取材：取饱满无缺口的太白贝母种子作为材料，用流水冲洗干净；（2）固定：将种子材料用吸水纸吸干表面水分，剥去种皮，用刀片去除种胚周围多余胚乳，然后迅速放入盛有FAA固定液的容器中固定，4℃冰箱放置24‑27h；（3）脱水：取固定好的种子材料，而后从低到高依次经过盛有50%→60%→70%→80%→90%→100%→100%系列浓度乙醇溶液的容器进行梯度脱水，每个浓度的梯度脱水时间为30min；（4）透明：采用盛有无水乙醇和二甲苯混合液的容器进行逐级透明，无水乙醇与二甲苯的比例依次为：4∶1→3∶2→2∶3→1∶4→0∶5→0∶5，每级透明时间为6h；（5）浸蜡：从种子材料透明彻底的容器中倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将熔点为52‑54℃的石蜡碎屑加入容器中，一直加到二甲苯完全饱和，容器置于混合蜡液在40℃下浸蜡24h，之后再用混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72h；混合蜡液由熔点为50‑52℃和熔点为58‑60℃的石蜡按重量比1∶1的比例融合而成；（6）包埋：种子材料浸蜡结束后马上用镊子转移到装有液态混合石蜡的纸盒中，调整好种子材料位置，再将纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶；（7）切片：根据种子材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片得到蜡带，控制切片厚度为6‑8μm；（8）粘片：在洁净的载玻片上均匀薄涂一层质量体积比为2%的明胶，将蜡带放在载玻片上，用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片在30‑35℃的水浴锅上放置2h，使蜡带光滑面紧贴载玻片之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干至少12h；（9）脱蜡：将上一步骤处理的切片依次放置于盛有纯二甲苯溶液→二甲苯与无水乙醇1∶1混合溶液→无水乙醇溶液→90%乙醇溶液→80%乙醇溶液→70%乙醇溶液→50%乙醇溶液→30%乙醇溶液→蒸馏水的容器中分别进行脱蜡，在每个容器的脱蜡时间为10min；（10）染色：脱蜡后的切片依次放置于20mg/mL的铁矾溶液中30min→5mg/mL的苏木精溶液中30min→20mg/mL的铁矾溶液中2min进行染色；.（11）脱水透明：染色后的切片依次经过盛有30%→50%→60%→70%→80%→90%→100%系列浓度乙醇溶液的容器中进行逐级脱水，每级脱水时间10min；后将切片依次经过无水乙醇与二甲苯的比例分别为：1∶1和0∶5的溶液中进行逐级透明，每级透明时间10min；（12）封片：从二甲苯透明的容器中取出切片，在二甲苯挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。2.根据权利要求1所述的太白贝母种子石蜡切片方法，其特征在于：步骤（2）所述的FAA固定液组成为：浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1∶1∶18。3.根据权利要求1所述的太白贝母种子石蜡切片方法，其特征在于：步骤（2）的材料处理去除了种胚附近多余胚乳。2CN115307995A说明书1/4页一种太白贝母种子石蜡切片方法技术领域[0001]本发明涉及一种植物种子石蜡切片方法，特别涉及一种太白贝母种子的石蜡切片方法。背景技术[0002]太白贝母(Fritillariaecirrho