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石蜡包埋切片方法.doc

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石蜡包埋组织样品制备方法 组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。以下操作依据组织大小及致密程度而定 1、组织的采集、固定和保存： 可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。此处只介绍实验室常用方法。 采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10min至1小时，4C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4-10m，贴于处理过的干净载玻片上，34C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4C密封保存。 石蜡包埋： 保存于4C70%乙醇中的组织样品  80%乙醇15min  95%乙醇15min  100%乙醇15min2  1/2乙醇1/2二甲苯15min  二甲苯透明5-10min  1/2二甲苯1/2石蜡30min  石蜡（1）1.5hr  石蜡（2）1.5-2.5hr  石蜡（3）包埋  4C保存 3、石蜡组织切片的免疫标记： 切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。 石蜡组织切片脱蜡、复水步骤： 密封保存于4C的组织切片  二甲苯(1)10min  二甲苯(2)10min  二甲苯(3)10min  1/2二甲苯1/2乙醇15min  100%乙醇5min  95%乙醇5min  80%乙醇5min  70%乙醇5min  50%乙醇5min  30%乙醇5min  d2H2O5min 4、石蜡组织切片的HE染色： 切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，也可用50mlH2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步骤）。之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。切片经梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊红中染色1～5秒或更长时间，95%乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。 石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水  苏木精室温5-10min  H2O迅速冲洗  0.1%盐酸乙醇1-2sec  流水滴洗  30%乙醇1min  50%乙醇1min  70%乙醇1min  80%乙醇1min  95%乙醇1min  伊红A液1min  伊红B液1-30sec  无水乙醇1min  无水乙醇5min2  1/2乙醇1/2二甲苯15min  二甲苯(1)5min  二甲苯(2)5min  二甲苯(3)5min  中性树胶封片，室温干燥保存