利用SRAP分子标记分析种质资源 实验方案.doc

利用SRAP分子标记分析种质资源
1SRAP分子标记
相关序列扩增多态性（SRAP）是由美国加州大学Li和Quiros于2001年发展的一种基于PCR反应的新型标记。该技术是基于正向和反向引物对模板DNA的PCR扩增，引物具有3个明显不同的序列框(motif)：5’端存在的10-11个随机碱基序列，紧跟着CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的碱基序列，最后是位于3’端的3个选择性碱基。从技术的可操作性来看，每个引物5’端的10个随机碱基序列可以促进任意序列的扩增，即类似于RAPD标记的结果。正向引物的CCGG序列可以优先与具有丰富GC碱基的外显子序列退火结合，而反向引物的AATT序列可优先与具有丰富AT碱基的内含子和启动子序列退火结合，引物3’端的3个选择性碱基可以对模板DNA进行选择。SRAP标记自开发以来，已在多种植物的遗传多样性分析、指纹图谱构建和物种亲缘关系分析研究等领域得到广泛应用。该标记具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以及成本较低等优点，具有RAPD简单快捷之优点，同时还具有AFIP的稳定性和多态性，是简单又经济、有效又可靠的分子标记系统。

2.1材料和试剂
2.1.1材料
从各种中各随机选取5-15株个体采集叶片用于提取基因组DNA。
2.1.2仪器与试剂
研钵、冷冻高速离心机、水浴锅、紫外分光光度计、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪
液氮、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒
氯化钠、EDTA二钠盐、醋酸钠、Tris、CTAB、盐酸、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、冰醋酸、无水乙醇、PCR试剂、琼脂糖
（1）2×CTAB提取液配制
2×CTAB提取液配制2×CTAB提取液终浓度母液5ml10ml15ml20ml1.4mMNaCl5MNaCl1.42.84.25.620mMEDTA0.5MEDTA0.20.40.60.8100mMTris-HCl(pH8.0)1MTris-HCL,pH8.00.51.01.52.02%(w/v)CTAB10%(w/v)CTAB1.02.03.04.00.2%(v/v)β-mercaptoethanolβ-mercaptoethanol0.010.020.030.04H2OH2O1.893.785.677.56（2）5MNaCl
（3）0.5MEDTA-Na2（pH8.0）
（4）1MTris-HCL（pH8.0）
（5）10%(w/v)CTAB
（6）0.2%(v/v)β-mercaptoethanol
（7）氯仿、异戊醇混合液（24:1）
（8）3MNaAc
（9）TE：10mMTris-HCl，1mMEDTA,pH7.4
（10）50×TAE电泳缓冲液（1L）：
Tris242g
冰醋酸57.1ml
0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml
工作液为1×TAE（40mmol/LTris-HAc,1mmol/LEDTA）

2.2基因组DNA的提取(CTAB法)和检测
采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
（1）取干燥叶片0.1g左右于研钵中，加液氮研磨成粉末，待液氮挥发完毕，将粉末迅速转移至离心管中；
（2）加入65°C预热的3mL2×CTAB提取液，65ºC水浴30min，期间稍加混匀；
（3）加入等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1，4mL），摇匀静止3min后室温离心10min（10000r·min-1）；
（4）取上清液转移至新的离心管，用0.8V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/0.1V3MNaAc沉淀DNA，-20℃下放置30min以上；
（5）4°C离心15min（12000r·min-1）；
（6）弃上清，沉淀用70%预冷乙醇洗涤两次，自然风干，加适量TE溶解；
（7）加RNaseA至终浓度10µg/ml，37ºC消化30min；
（8）加等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1），翻转充分摇匀，室温离心10min（12000r·min-1）；
（13）取上清液转移至1.5mL离心管，加入.8V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/0.1V3MNaAc沉淀DNA，轻轻翻转摇匀，-20°C冰箱过夜；
（14）4°C离心15min（12000r·min-1），弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，并自然风干；
（15）加入100μlTE溶液，冷冻备用。
基因组DNA浓度检测
用紫外分光光度计（日本岛津UV-2401PC）测定260nm/280nm处的光吸收值，根据A260/A280确定DNA的纯度，根据260nm处的光吸收值估测样品DNA的浓度；用1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度和浓度来检测其纯度和浓度，根据电泳条带的整齐度、点样孔中荧光的有无估计DN