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蛋白酶活性检验方法
1定义
1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2福林法（第一法）
2、1原理
蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2试剂和溶液
2、2、1福林试剂的制备
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L
称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000mL。
2、2、3三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。
2、2、4氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
按GB601配制。
2、2、5盐酸溶液c（HCI）＝1mol/L及0.1mol/L
按GB601配制。
2、2、6缓冲溶液
a、磷酸缓冲液（PH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（PH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（PH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。
2、2、710g/L酪素3）溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中
边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
注：3）酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。
2、2．8100ug/mLL－酪氨酸4）标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
注：4）L－酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。
b、吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mLL－酪氨酸标准溶液。
2、3仪器和设备
2、3、1恒温水浴40±0.2℃。
2、3、2分光光度计应符合GB9721的规定。
2、4分析步骤
4、1标准曲线的绘制
a、L－酪氨酸标准溶液
按表3配制
表3
管号酪氨酸标准溶液的浓度
ug/mL取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积
mL取水的体积
mL000101101922028330374404655055b、分别取上述溶液各1.00mL（须做平等试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。
4、2测定
（1）待测酶液的制备
a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（