发根农杆菌.ppt

发根农杆菌介导的植物遗传转化农杆菌质粒介导的基因转移系统是植物基因工程中比较完善而有效的方法。在转基因植物中有80％以上是由农杆菌介导转化的，但是其中大部分是由根癌农杆菌Ti质粒介导获得的。1982年Chilton报道发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)能诱导植物产生发状根(Hairyroot)，这种发状根又称毛状根，是由发根农杆菌所含有的Ri质粒(Rootinducingplasmid)引起的。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌在植物遗传转化方面具有明显的优越性。
用Ti质粒作为基因载体时．由于Ti质粒T-DNA区的癌基因经常造成被转化的植物组织形成肿瘤，阻碍正常植物的再生，为了防止肿瘤的形成，常采用除去Ti质粒T—DNA区癌基因的方法，即“解除武装”，而用Ri质粒作为基因载体时，不需要“解除武装”，从其转化的植物细胞上很容易再生出植株；
Ti质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非转化细胞所构成的嵌合体，而发根农杆菌转化植物产生的毛根来源于同一个植物细胞，因此，毛根的每一个细胞都是转化的；
毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择；
Ri质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核染色体上插入一个T-DNA拷贝的株系。
毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次生代谢产物等特点。
由毛状根再生的植株经常表现出节间短、顶端优势比较弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有利。发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。
Ri质粒为根诱导质粒(RootInducingPlasmid)；Ri质粒的大小为200～800kb，它含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因，在结构上有致毒区(Vir区)，转移进入植物细胞核的T-DNA区及其内部的冠瘿碱合成功能区等。
根据其合成冠瘿碱的不同，可将Ri质粒分为4种类型：
①甘露碱型(MannopineType)，合成甘露碱及其酸、农杆碱酸与农杆碱素A；
②黄瓜碱型(CucumopinType)，合成黄瓜碱；
③农杆碱型(AgropineType)，合成农杆碱及其酸、甘露碱及其酸、农杆碱素A；
④米奇矛型(MikimopineType)
Petit等发现含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌较甘露碱型、黄瓜碱型和米奇矛型有更为广泛的宿主范围。Ri质粒Ri质粒通过T-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。农杆碱型Ri质粒上的T-DNA呈不连续分布，TR-DNA及TL-DNA上的基因与毛状根的形成有关，同时也影响着再生植株地上部分形态和一些生理性状。TR-DNA的基因tmsl和tms2能指导IAA的合成，因此转化生成毛状根在培养时不需要添加生长激素。所有Ri质粒Vir区的保守性很高，在转化过程中，Vir区上的基因不发生转移，但它对T-DNA的转移起着极为重要的作用；在通常状态下，Vir区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染植物时，受损伤植物合成乙酰丁香酮，使Vir区抑制状态的基因被激活，产生限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生T-DNA链，并引导T-DNA链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物细胞核内，T-DNA随后整合进入植物细胞基因组。发根农杆菌感染植物的方法发根的鉴定发根农杆菌
1.1菌株类型
目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱型的A4、ATCCl5834、16834、LBA9402及1601、R1000、R1200等人工构造质粒；还有黄瓜碱型的2635、2657、2659等；以及甘露碱型的5196、TRl01、TR7等，每一种菌株对不同植物的发根能力是不同的。
1.2菌液浓度
一般菌种浓度过大，细菌生长迅速，一定程度上抑制细胞代谢过程，且不易除菌；浓度太稀，能附着在细胞的细菌太少，不足以形成足够的毛状根。植物及其外植体
2.1植物种类
目前转化成功的植物主要是草本植物，尤以双子叶植物为多，也有为数不多的单子叶植物(如栝楼、旱墨莲、露水草)和少数木本植物(如银杏)等诱导成功。
2.2外植体类型
已成功诱导出毛状根的植物外植体有叶片，茎、子叶、愈伤组织、下胚轴等多种，但不同的外植体发状根的诱导率不同。究竟植物的哪一部分器官最适合用于转化，并无严格的规律可循，但一般采用的都是较幼嫩的组织，因为这些细胞处于旺盛的分裂状态，容易接受外源DNA。

化学因子
3.1培养基
一般而言，高盐培养基如MS、LS等有助于毛状根的形成；而低盐培养基如B5等则有助于细菌增殖，在毛状根形成后的除菌过程中，除菌比较困难。
3.2外源激