发根农杆菌转化龙胆再生植株的研究.docx

发根农杆菌转化龙胆再生植株的研究
植物转化技术是现代生物学领域的研究热点之一。发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一种广泛存在于土壤中的土壤杆菌科细菌，具有可移动DNA片段（T-DNA），能利用T-DNA将其外源基因DNA插入到寄主植物内，从而实现外源基因的转移和表达，成为植物基因工程实验中常用的载体之一。龙胆（GentianamacrophyllaPall.）是一种花卉植物，由于其生长周期长、繁殖难度大等因素，限制了其应用范围，但是其具有很高的药用价值和观赏价值。本文以发根农杆菌转化龙胆再生植株的研究为题目，探讨利用该技术改良龙胆品种的可能性。
一、龙胆发根再生体系的建立
龙胆是我国草本植物科的重要成员之一，是中药材和观赏植物。本研究选取丰富营养的龙胆幼嫩茎尖和叶片，采用MS培养基作为基础培养基，添加1.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA，调整pH至5.8，培养14天，可获得较为丰富、良好的初级发根。将初级发根移植至含有0.5mg/LIAA和0.1mg/LGA3的基础培养基，继续培养2-3周，即可获得完整的龙胆植株。此方法可实现龙胆通过无性繁殖的方式进行再生，为其繁育提供了可行的途径。
二、发根农杆菌介导龙胆转化
1.制备Agrobacteriumrhizogenes菌株
本研究使用带有NEO和GFP标签的发根农杆菌ATCC15834。接种于100mLLB液体培养基中，置于28℃摇床培养10-12h，OD600值为0.6-0.8时，以5000rpm离心10min，去除上清液，取菌体于不含植物素的MS培养基中重悬，制备接种液。
2.处理龙胆茎秆
将1cm长的龙胆茎秆剪取，分别在含有100μMAS和1.5g/L质量浓度的MS培养基和不含有植物素的MS培养基中浸泡。培养2天后，取出茎秆，置于含有接种液的MS培养基中，移至4℃禁光培养2h，然后移至28℃培养36h。
3.培养转化植株
将处理后的龙胆茎秆经过细胞分裂，形成表现出GFP荧光的生长点，将其移植至含有添加抗性选材剂kanamycin的MS培养基中，经过4周培养，形成抗性菌落，即可筛选得到转化成功的龙胆再生植株。经过PCR验证和各种生化方法分析，证明该结果成功引导龙胆DNA片段嵌入到宿主植物基因组中。
三、结论
本研究建立了适用于龙胆的发根再生体系，并成功地实现了发根农杆菌介导龙胆转化，经过筛选得到抗性对抗性选择剂的龙胆再生植株。该研究结果为将来利用基因工程改良龙胆品种提供了一种可行的途径。