动物基因组DNA和RNA的提取.ppt

实验一动物基因组DNA和RNA的提取二、实验原理核酸的理化性质分离纯化核酸总的原则：核酸制备时应注意的事项:
降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。

对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。

对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。

②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制
①操作要带手套。
②所有器皿要严格消毒，
③试剂处理
④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。常用的RNA酶抑制剂核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。
去垢剂的作用：
1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；
2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；
3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。作用：
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。

3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
核酸制备中常用的酶
DNase:降解DNA
RNase：降解RNA
蛋白酶K：降解蛋白质
溶菌酶：破碎细胞
3.核酸制备的一般步骤：
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。
高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，
冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。
动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。
细胞器DNA：首先纯化细胞器。

以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂2）破碎抽提核酸除去杂质
首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离
使核酸与蛋白质分离
除去脂类
多糖的除去3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质

温度：
4℃样品经常使用
-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存
-20℃保存,避免反复冻融

保存介质：
灭菌水
TE缓冲溶液(最常用)：
10mmol/LTris-ClpH8.0
1mmol/LEDTApH8.0三、动物基因组DNA的提取三、动物基因组DNA的提取三、动物基因组DNA的提取DNA的提取：苯酚抽提法1）在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2）沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3）彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4）加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。
6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。3.注意事项——材料准备3.注意事项——细胞裂解3.注意事项——核酸分离、纯化3.注意事项——核酸沉淀、溶解

1．材料：
组织或者细胞

2.方法：
TRIzol法，试剂盒

总RNA提取试剂盒1．TRIzol试剂

2．氯仿

3．异丙醇

4．75%乙醇（DEPC水配制）

5．DEPC水
操作步骤将离心管置于冷冻离心机2-4C10000rpm/min离心15min，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30C温育15min以沉淀总RNA；
将离心管置于冷冻离心机2-8C10000rpm/min离心15min，弃上清；
加入2mL用冰预冷的75%乙醇漂洗，2-8C7000rpm/min离心
5min，弃上清，于室温干燥10min；
加入适量DEPC处理水并于55-60C水浴
温育10min