柑橘DNA和RNA提取方法.docx

CTAB法提取柑橘DNA参考自：程运江.柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究[D].华中农业大学,2004.实验准备工作：1所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。2试剂配制：1MTris-HCl(pH8.0):称取Tris-Base121g,加入约800ml水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000ml.灭菌后于室温保存。0.5MEDTA(pH8.0):称取EDTA-Na2盐187g加入约800ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可,灭菌后于室温保存。5.0MNaCl:称取NaCl300g,加入蒸馏水约800ml于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000ml.,灭菌后于室温保存。酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：250mlTris-饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，充分混合，静止分层（一般为过夜），就可使用，配好之后放4℃冰箱保存。氯仿：异戊醇（24:1）：240ml氯仿+10ml异戊醇76%乙醇+10mMNH4Ac：380ml无水乙醇+120ml无菌水+0.385gNH4AcTE：200ml无菌水+2μl1MTris-Hcl+0.4μl0.5MEDTA水饱和乙醚：乙醚中加入无菌水，混合，分层后可使用。DNABuffer的配制：1MTris-HCl(pH8.0)100ml0.5MEDTA(pH8.0):100ml5.0MNaCl:300mlH2O500ml灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇(现配现用)。DNA的提取：1取3g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20mlDNA提取缓冲液充分摇匀，于65℃水浴60~90min，中途轻轻摇匀两次。2加入15ml氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000rpm离心15分钟。3取上清液于另一50ml离心管加入10ml氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。4吸上清液于一干净的50ml离心管，加入15ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000rpm离心10分钟。弃上清液，加入5ml76%的乙醇（含10mMNH4Ac）浸泡5h（或过夜），中途换乙醇2-3次。5弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0mlTE缓冲液（10mMTris-HClpH8.0；1mMEDTA,pH8.0），20µlRNaseA（10mg/ml），37℃温浴过夜。6溶液转入一10ml离心管，加入3.0ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000rpm离心15min，吸上清液于另一10ml的离心管中，（一般不重复）。7加入1ml5.0M的NaCl和3.0ml水饱和乙醚，充分混匀，4000rpm离心5min。8弃乙醚，用20µl枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10ml离心管。【去除果胶】9加入5ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000rpm离心10分钟。弃上清液，加入3ml70%的乙醇浸泡4~6h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500µlTE溶解，或浸在乙醇中长期保存。DNA检测取DNA原液15µl稀释至3.0ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230nm、260nm及280nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A230>2.0；1.7<A260/A280<1.9将DNA原液适当稀释后，用1ΧTAE，0.8%琼脂糖凝胶120V电泳30min进行质量检测。CTAB法微量提取柑橘DNA参考自：程运江.柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究[D].华中农业大学,2004.DNA的粗提取0.1g叶片研磨，研细后加入600μlCTAB提取液，再摇晃使其悬浮均匀在65℃水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次水浴之后，加入700μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），，上下晃动10分钟以上，使之充分混匀，然后12000rpm离心10分钟吸取上清液转至另一离心管中，加入60μl5MNaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA10000rpm离心5分钟，弃上清液加入1ml70%酒精浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。DNA检测:分光光度计检测D260/D280的比值：