目的基因的制备.ppt

第五章目的基因的制备一概述二什么是目的基因第一节目的基因的制备1.1限制性核酸内切酶酶切分离法所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。
1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段1.2.1.4三种方法各有利弊O第一节目的基因的制备2、从基因组文库中钓取目的基因2.1.2基因文库构建的材料来源2.1.3基因文库的完备性Forexample:
期望值为0.99，插入片断为20kb的E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算

NE.coli==1.1×103
2.1.4基因文库的质量标准2.1.5基因文库的构建技术路线2.1.5.1基因组DNA的制备2.1.5.2载体的选择2.1.5.3载体与基因组DNA的切割2.1.5.4载体与外源片段的连接（1）连接酶（2）连接反应的效率（3）避免外源DNA片段之间的连接措施2.1.5.5重组DNA导入宿主及筛选密集铺板（1-10万）构建噬菌体基因组文库的主要步骤用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤2.1.5.6基因组文库重组克隆的排序（1）酶切片段末端标记法H（2）随机探针联合杂交法（3）染色体走读法（chromosomewalking）染色体走读法（chromosomewalking）染色体走读法（chromosomewalking）2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因（1）核酸杂交方法（4）PCR筛选法从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个横向克隆与8个纵向克隆分别混合，形成12个横向池及8个纵向池，进行20个（8+12）反应，如图，横向阳性池与纵向阳性池交叉的孔为阳性单克隆，通过44个反应可从2304个克隆中筛选分离出单个克隆。大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图第一节目的基因的制备3从cDNA文库中钓取目的基因3.1.1.cDNA（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达。
（3）包含了所有编码蛋白质的基因。
（4）比DNA文库小的多，容易构建。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。反转录酶用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。④去掉发卡结构在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。3.2cDNA克隆的操作流程第一节目的基因的制备4通过PCR直接扩增出目的基因通过PCR直接扩增出目的基因策略4.1套式PCR（nestedPCR）4.2反向PCR(inversePCR)首先，用限制性核酸内切酶消化待测线性DNA模板。
其次，使酶切后的线性DNA模板连接成为环状分子，或加上衔接头后再连接成环状。
第三，用另一种限制酶消化，将环状DNA从已知区域中间切开，则线性化DNA的两侧为已知序列，未知区域夹在中间，用与已知区域可使未知序列大量扩增出来。4.3锚定PCR(anchoredPCR)其基本步骤4.4反转录PCR（RT-PCR）第一连续RT-PCR(两阶段单管式)第二长距离RT-PCR(两阶段双管式)4.5锅柄PCR（panhandlePCR）锅柄PCR实施步骤第五章目的基因的制备第二节目的基因的分离第二节目的基因的分离第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选法1.2功能互补法克隆基因第二节目的基因的分离2序列克隆法筛选把滤膜放在平板上，将噬菌斑中的噬菌体颗粒影印到滤膜上，使噬菌体DNA结合在滤膜上。把滤膜放入含有放射性标记的探针的溶液中杂交。杂交后洗去膜上非结合的探针，经放射自显影确定。然后根据X线片上的放射性位点寻找相应的噬菌斑，从而分离到与探针顺序互补的目的克隆。2.2表达序列标签法分离目的基因2.2.2基本步骤3筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术利用差别杂交法筛选生长因子调节基因图局限性3.2减法杂交技术3.2.1mRNA减法杂交以mRNA减法杂交为例，基本原理是，从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA,然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态,将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。3.2.2基因组DNA减法杂