酶的提取和分离纯化.ppt

11酶的提取与分离纯化思考题本章主要内容11.酶的提取、分离纯化11.1酶的提取、纯化的基本原则注意点酶分离纯化的工艺流程设计酶分离纯化的工艺流程设计材料选择及其前处理11.2细胞破碎11.2.1机械破碎法机械破碎法11.2.2物理破碎法1.温度差破碎法2.压力差破碎法Manton-Gaulinhomogeniservalve压力差破碎法压力差破碎法3.超声波破碎法11.2.3化学破碎法（1）有机溶剂处理（2）表面活性剂处理11.2.4酶学破碎法2.自溶法丙酮干粉的制备11.3酶的抽提（萃取、提取）抽提剂抽提剂的组成11.4浓缩与初步提纯2.初步提纯11.5酶的分离纯化方法酶的分离纯化方法11.5.1根据溶解度不同进行的纯化一、盐析法球蛋白溶解度-溶液离子强度关系盐析盐析盐析盐析二、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法三、共沉淀法共沉淀法例子四、选择性沉淀法五、等电点沉淀法等电点沉淀法六、液－液分离法双相水溶液分离法(aqueoustwo-phaseseparation)11.5.2按分子大小进行的纯化一、凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱二、膜分离技术膜分离技术透析三、离心11.5.3根据电学解离性质不同进行的纯化一、吸附交换（色谱）吸附色谱吸附色谱2.羟基磷灰石吸附3.离子交换色谱（一）离子交换剂的选择（二）离子交换色谱主要操作过程(三)离子交换色谱的基本原理（四）离子交换色谱的适用范围二、电泳分离法纸电泳（一）凝胶电泳
凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的分辨率。
（二）等电聚焦
在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚集于与其相当的等电点pH位置上，不再移动而达到分离的目的。
优点：高分辨率
缺点：不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶(PAG)DISC电泳(Discontinouselectrophoresis)（三）SDS- PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一般电泳中，迁移率m∝q/f，q-颗粒电荷，f-摩擦系数。
SDS电泳中m仅与蛋白质（亚基）的分子量有关，㏒M=C-bm。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳因此可用于蛋白质分子量的测定。
SDS-PAGESDS-PAGESDS聚丙烯酰胺凝胶电泳评介纯度Assesspurity三、聚焦色谱聚焦色谱聚焦色谱2.选择适宜的pH梯度范围3.交换剂的用量5.洗脱聚焦效应聚焦色谱过程6.多缓冲液和蛋白质组分的分离7.交换剂的再生与贮存11.5.4利用专一亲和作用进行的纯化一、亲和色谱（一）亲和色谱剂亲和色谱剂（二）吸附（三）洗涤和洗脱1.装柱Loadingaffinitycolumn.2.加样3.蛋白质与亲和色谱剂作用4.洗出没有结合的蛋白质5.洗出结合松散的蛋白质6.洗脱结合紧密的蛋白质，收集目的物二、亲和电泳法亲和电泳法三、亲和洗提11.5.5高效液相色谱HPLC(略）11.5.7酶的结晶11.6酶的纯化步骤二、酶纯度的检查11.7酶纯化步骤的定量评价酶的单位（U）二、比活力三、酶的得率或回收率几种酶的分离纯化11.8酶的提纯标准及剂型PreparationofenzymesforsaleApproachestomaintainenzymeactivityEffectofionsonenzymestabilisation