高效液相色谱法测定维生素E胶囊中α-VE的含量(2015).doc

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高效液相色谱法测定VE胶囊中α-VE的含量

目的要求
了解高效液相色谱仪的基本构造和工作原理。
掌握高效液相色谱仪的正确操作方法。
学习维生素E的定量分析方法。

实验原理
色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号被检测。
高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)。按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。RPC一般用非极性固定相（如C18、C8），在现代液相色谱中应用最为广泛，约占整个HPLC应用的80%左右。
维生素E又称生育酚，目前已经确认的有8种异构体，αβγδ生育酚和αβγδ生育三烯酚，天然存在的α-生育酚的维生素E活性最强。α-生育酚醋酸酯是α-生育酚的酯化产品，常用在维生素胶囊中，具有很强的氧化稳定性。
样品以乙醇溶解，采用RPC法，以乙醇为流动相，C18色谱柱分离，紫外检测器284nm波长检测，外标法定量，测定维生素E胶囊中α-生育酚醋酸酯的含量。

仪器和试剂
维生素E醋酸酯标准品、色谱纯乙醇、分析纯四氢呋喃、无水乙醇。
HPLC高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10A泵，SPD-20A紫外双波长检测器）、KQ5002B型超声波清洗器、、紫外可见分光光度计。

实验条件
色谱柱为EclipseXDB-C18柱(150mm×4.6mm，5μmi.d.);流动相为乙醇，流速0.5mL/min;进样量20μL;UV检测器，检测波长为284nm(通过紫外分光光度计扫描确定)。

实验步骤
1、流动相过滤和脱气
流动相乙醇用0.45µm（或0.22µm）有机滤膜滤过，以除去杂质微粒，然后超声脱气（一般500ml溶液需超声20~30min方可）。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。处理好的流动相贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，恢复到室温后使用。
2、标准溶液的配制
储备液：准确称取标准品VE醋酸酯3用无水乙醇溶解使浓度为10mg/mL。
工作液：测定前用无水乙醇VE标准储备液稀释至1mg/mL。
应用液：测定时用无水乙醇将工作液稀释成10、50、100、150、200µg/mL浓度标准系列溶液。
3、试样溶液的制备
用针刺破维生素E软胶囊称取油状物约0.1g，置10mL烧杯中，加入无水乙醇超声溶解后转移至25mL容量瓶定容，检测前再稀释后经0.45µm有机滤膜过滤为待测液。
4、开机
接通电源，依次开启电源、泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。
5、更换流动相并排气泡
流动相的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；逆时针转动泵的排液阀180°（不能超过180°），打开排液阀；按泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。
6、平衡系统
打开“在线色谱工作站”软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，按“下载”按钮。参数载入。启动泵，pump指示灯亮。用检验方法用流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，检查管路后再操作。观察基线变化，如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。
7、进样、检测
进样前按[零点校正]按钮校正基线零点。用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次。
8、色谱柱的清洗
分析工作结束后，先关检测器。清洗进样阀中的残留样品，然后用乙醇以分析流速冲洗色谱柱15-30分钟，在甲醇冲洗时重复注射100-200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质，特殊情况应延长冲洗时间。
9、关机
实验完毕后，关闭仪器和电脑。

六、实验数据和处理
1、标准曲线绘制
C
A
次
数
123平均
2、样品测定
123平均峰面积
3、计算