结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化.pdf

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结核分枝杆菌./!!"#基因的表达和纯化

吕冲，姜昕，顾晓玲，王洪海"

（复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海$%%!((）

摘要：在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌JH(("F蛋白，获得纯化的重组蛋白1JH(("F。通过聚合酶链反应
（K.5L;018I0,=8<?108,-<.?，KMJ）扩增JH(("F基因；以质粒N:4$’8为表达载体，构建重组质粒，转化大肠杆菌2O$&
（P:(）；以异丙基硫代半乳糖苷（QK4R）诱导表达目的蛋白，通过SPS6K3R:鉴定1JH(("F在大肠杆菌中的表达，确定
1JH(("F在大肠杆菌中的表达形式；采用T<6T43U<I·2<?DJ0I<?来纯化重组蛋白。重组质粒N:4$’86JH(("F中目的
基因测序结果与报道序列相同。分子量约&FV#WP8，表达量约占菌体总蛋白的&’X，纯化后的重组蛋白样品经SPS6
K3R:和激光密度扫描分析表明其纯度为F%X以上，每&%%;O培养菌可获得&V#";@左右的重组蛋白。用亲和层析
法纯化的重组蛋白纯度较好。
关键词：结核分枝杆菌；JH(("F；基因表达
中图分类号：J(F$文献标识码：3文章编号：%%%&6"$%F（$%%"）%#6%’(#6%(

结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，威胁!#$引物设计
着人类的生活质量和生命健康。据世界卫生组织（YU+）统根据R0?28?W库中报道的基因序列设计两对引物，引物
计，目前世界上约有$%%%万以上的结核病人，每年约有’%%序列为：上游引物K&序列为：#]6333R3344M34R4RRRM3RR
［］
万人新发生结核病，近(%%万结核病病人死亡&。近年来，M43MMR44RR6(]；下游引物K$序列为：#]633433RM444M3R
由于人口流动普遍增加、人类免疫缺陷病毒（UQZ）与结核分MMMR4RRRMR4MR4MM6(]。K&、K$中划线部分分别为2&’J"、
枝杆菌（$%&’()&*+,-./*.(+,&.0’1-1，简称[42）伴发感染以及耐4-5D#酶切位点。
药菌株的出现等原因，使[42感染和结核病发生率有上升!#%目的基因的获得
［$］以基因组为模板，用技术获取目
趋势，给全球结核病防治提出了新的挑战。因此及时进行[42U(*JHPT3KMJ
结核病的早期诊断，研究更有效的结核病免疫诊断试剂或者的基因。KMJ反应条件为：F"^&;<?，##^&;<?，*$^&;<?，(%
疫苗对治疗结核非常重要。个循环。
本文通过在大肠杆菌中克隆、表达结核杆菌JH(("F蛋!#&表达载体的构建
白，获得纯化的1JH(("F蛋白，为更深入研究该蛋白的免疫学目的基因片段与N:4$’8质粒载体连接，转化大肠杆菌
特性，研究更有效的结核病免疫诊断试剂或者制作疫苗打下PU#!，KMJ扩增及酶切鉴定重组质粒。用2&’J"及4-5D#
基础，同时也为该蛋白是否可以作为复合抗原的一个组分提酶切处理阳性重组质粒及N:4$’8质粒，琼脂糖凝胶回收后
供依据。进行连接反应，转化大肠杆菌2O$（&P:(）感受态细胞。酶切
及测序两种方法双重鉴定重组质粒。
!材料和方法
!#’目的基因的诱导表达和()(*+,-.分析
在平板上挑阳性克隆转种培养基，培养至
!"!材料O2(*^8"%%
!#!#!质粒和菌株：大肠杆菌（21&3+,-&3-)&’0-）PU#!、大肠杆_%V")%V’时，%V$;;.5‘OQK4R诱导表达()!=收获菌体。
菌（）、质粒均为本实验室保存，适量菌体悬浮于样品缓冲液中，煮沸处理，离心后取
2O$&P:(N:4$’8[42U(*JH$aSPS
菌株由上海市肺科医院提供。上清，SPS6K3R:鉴定目的蛋白的表达。
重组蛋白的纯化
!#!#$酶和试剂：限制性内切酶2&’J"、4-5D#购自!#/
48\8J8公司；4!PT3连接酶购自美国T0>:?@58?D2<.O8/I；采用T<6T43U<I·2<?DJ0I<?来亲和纯化重组蛋白，具体
6)7N5CIPT3聚合酶购自上海申能博彩生物科技有限公司。操作步骤如下：（&）收集超声后的沉淀，加入$%;O裂解液
（、、咪唑、
T<6T43U<I·2<?DJ0I<?购自美国T.H8@0?公司；KMJ产物纯化2CBB012&%%;;.5‘OT8U$K+!&%;;.5‘O41<I6UM5#;;.5‘O
试剂盒、PT3胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、细菌PT3抽’;.5‘O