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SD大鼠骨髓间充质干细胞培育流程

姓名：李静专业：血液内科学号：2导师：赖永榕

研究背景

骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)起源于中胚层，
是优质的种子细胞，亦是骨髓中存在的除造血干细胞外的另一类干细胞。由于
取材相对方便，易于体外扩增，和免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植
领域取得了普遍的关注。可是骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量超级少，在骨

髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数%~%，含量极低。而同时，由于组织工程需要
大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技术上的难度限制了许多实
验的开展。体外分离培育纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程
及细胞的体内、体外实验显得相当重要。

研究目的

本实验通过BMSCs的黏附特性，应用全骨髓贴壁培育法，成立了一个简便、
有效的原代培育、增殖和纯化BMSCs的方式，观看大鼠BMSCs的生物学特性，为
后续利用BMSCs医治血液疾病的研究提供稳固的干细胞模型。

一、实验材料与方式

（一）材料与试剂

生后30d的雄性SD大鼠，体质量100g，SPF级；DMEM培育基；青霉素、
链霉素；胎牛血清；淋巴细胞分离液；%胰蛋白酶；兔抗鼠CD34、CD44、CD45、
CD105、CD90荧光抗体；CO培育箱；倒置相差显微镜；SW-CJ型生物干净工作
2
台。

（二）方式

BMSCs的原代分离培育：2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75%乙醇全身浸
泡消毒10min。无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺
端，露出骨髓腔，用添加青、链霉素的L-DMEM培育基冲出骨髓，反复吹打；将
冲出的骨髓制成单细胞悬液。将冲洗下来的液体制成单细胞悬液，经Percoll
密度梯度离心法，分离和搜集有核细胞，用含15%胎牛血清的DMEN-LG培育基重

悬离心管中的骨髓间充质干细胞，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，
CO培育箱培育，换液，将骨髓间充质干细胞不断纯化。当细胞生长融合达
2
80%-90%时，用1:1的%胰蛋白酶和%乙二胺四乙酸溶液消化分散细胞，在显微镜

下操纵消化时刻，计数细胞，以1:3密度扩增培育。现在标记为P1代。

BMSCs的培育、纯化及传代：原代培育进程中，48h后全量改换培育基，以
后每3d全量改换新鲜培育基。待细胞铺满培育瓶底至细胞融合成单层，密度长
至70%~80%融合时，用%胰酶消化，1：2的比例进行传代培育。

BMSCs的形态学观看及Giemsa染色：培育后每日用倒置相差显微镜观看细

胞形态转变及生长状况并拍照。将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107

/L，接种到12孔细胞培育板中，每孔接种，以后每3d换液。待细胞散布均匀、
约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10min，Giemsa染液染2min，蒸馏水冲洗，
显微镜下观看拍照。

BMSCs生长曲线测定：将生长状态良好的SD大鼠骨髓间充质细胞传至2代并

接种于96孔培育板，接种密度5×103/孔，将培育板移入CO2培育箱中培育。每
日取一板进行MTT检测。选择492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收
值，记录结果。以时刻为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

BMSCs的细胞周期检测：取第3代细胞，调整细胞浓度为×109/L。加100μL
RNaseA37℃水浴30min，再加入400μLPI染色混匀，4℃避光30min，流式
细胞仪检测细胞周期。

BMSCs鉴定：流式细胞仪检测细胞表面标记：收成P3代生长状态良好细胞，%
胰酶消化，4℃离心，1000r/min，5min，用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数
细胞，各管依次加入单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90、CD105。同时每管
样品设立同型阴性对照。避光冰上孵育45min，用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，
以除去未结合抗体，用500μLPBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测
分析。

二、讨论
MSCS那个概念是由Friedenstein和他的同事在40连年前提出的。随后的研
究发觉其具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓间质等多种间充质组织分

化的潜能,近来又有研究发觉BMSCs与肿瘤的发生、进展有着重要的联系。因此,
如何培育出高纯度、稳固的BMSCs,是进行更深一步研究的基础。

骨髓中间充质干细胞的含量较低,约为%～%。目前用于分离BMSCs的方式要
紧有四种:贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。贴壁

细胞分离法是最先的方式,是依照MSC具有在塑料组织培育瓶中贴壁生长的特
性对其进行分离;但所得细胞的成份复杂,骨髓间充质干细胞的纯度不足。密度