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大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步,SD大鼠麻醉处死,75%乙醇皮肤消毒,无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉,取股骨及胫骨,浸泡在PBS中。 心得体会:①鼠龄4周,重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了,骨髓都分化的太厉害,没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行,但是雌的比较厉害,咬人。Wistar大鼠行不行,也行,但是就品种而言,SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起,腹腔麻醉,保证30秒老鼠躺倒,安乐死。如果你水平够高,可以直接用注射器抽取心脏内的血液,可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行,但老鼠太小,前肢更小,如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中(也可以用培养皿),管中提前加好含有青链霉素的PBS10ml就行了,青链霉素的浓度为500U/ml,这样是区别于生长液中青链霉素浓度,组织抑菌是200-500U/ml,生长液抑菌是20-100U/ml。就当初步的消毒吧! ④整个手术过程要快,一般控制在20分钟之内,时间长了,骨髓会凝,不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝,可以叫上研究脂肪的,嗅鞘的,心肌的其他人员一起来,把剩下不要的老鼠尸体给别人,做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了,具体根据个人经验而言。 第二步,⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台,倒掉PBS后,再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端,暴露出骨髓腔,用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液,用针头插到骨头的一端冲洗,然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中(皿最好倾斜45度),冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头,反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中,大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会: ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取,放到一次性培养皿的皿盖上,皿是用来承装细胞悬液的,这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中,所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了,甚至更少,如果不够5ml,可以加至5ml,这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准,基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留,方便去除的,相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞,当然这个过程要轻柔,避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的,因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失,临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用,但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液(含有glutamine的,Gibco公司的,500ml一瓶,大约60元)浓度90%,5ml细胞生长液中大约需要4.5ml 胎牛血清(HYCLONE公司的,500ml一瓶,大约3600元)浓度为10%,5ml细胞生长液中大约需要0.5ml L-VC(自己配)浓度为50ug/ml,5ml细胞生长液中大约需要25ul 青链霉素(HYCLONE公司的,100ml一瓶,大约190元)浓度为10万U/ml,5ml细胞生长液中大约需要5ul 至于NaHCO3,一般是加的,浓度为7.5%,使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间,但是我不加,因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物,最好先拿试纸测一下。 再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少,可以忽略不计,但只是在配小剂量的范围内,大剂量的话就要酌情改变。 第三步:细胞计数。①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个培养皿。②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水,滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中,用枪头在这三者的混合液中抽吸几次,充分搅匀。④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中,刚好填满。开始计数并算出细胞数数量及浓度。并按浓度分装到培养皿中。 心得体会:①计数的这个培养皿可以是污染的,只要看的干净就行。 ②混合的液体为20+170+10=200ul。其中细胞悬液的浓度为10%,也就是说细胞悬液被稀释了10倍(也可以稀释至20倍,稀释的越多,更容易数清楚,但误差也随之增大)。③计数公式:细胞数×104/ml=(四个大方格细胞数÷4)×稀释倍数×104/ml比如,你数了四个大方格中有拒染细胞400个,那么根据公式算出 (400÷4)×10×104/ml=1×107/ml,现在有5ml的细胞悬液,也