猪胸膜肺炎放线杆菌毒素II基因的克隆、表达及其对小鼠.pdf

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2006,14(4):493~497
·研究论文·

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素基因的克隆、表达及其免疫原性*
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严克霞1,刘建杰2,吴斌1,汤细彪1,蔡利军1,杨明柳1,陈焕春1,周锐1**
(1.华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室,武汉430070;
2.海口农工贸（罗牛山）股份有限公司，海口570125)

摘要：以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(serotype2，APP-2）菌株HB08的
基因组为模板，扩增了2871bp的APP毒素的结构基因，并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒
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pET28，转化到大肠杆菌()BL21(DE3)，经SDS-PAGE和Westernblot分析表明，表达的重组蛋白具有良好
的反应活性。将表达的蛋白经或不经复性处理，与纯化的天然毒素分别免疫昆明小鼠，同时设PBS空白对照组，每组12只，
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间隔2周免疫2次，采血检测其抗体效价，二免后2周用致死剂量的APP血清7型（APP-7）菌株（1.08×108CFU(菌落形成单
位,colonyformunit)/只）腹腔攻击。结果显示，复性蛋白组的保护率为83.3％，非复性蛋白组的保护率为58.3％，天然毒素蛋白
对照组保护率为91.7％，空白对照组小鼠全部死亡，说明复性的重组毒素具有良好的免疫原性。
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关键词：胸膜肺炎放线杆菌;毒素;克隆;原核表达;免疫原性
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中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)04-0493-05

Cloning,ExpressionandImmunogenicCharacterizationofGeneof

YANKe-xia1,LIUJian-jie2,WUBin1,TANGXi-biao1,CAILi-jun1,
YANGMing-liu1,CHENHuan-chun1,ZHOURui1**,

ThestructuralgeneencodingApxtoxin()wasamplifiedfromthegenomicDNAof
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serotype2(APP-2)strainHB08andclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a.SDS-PAGEand
WesternblottinganalysisshowedthatthegenewasexpressedinBL21(DE3)andtheexpressionproducts
couldreactwithApxantibodies.TherecombinantApxwaspurifiedfromtheinclusionbodies.Kunmingmicewere
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intraperitoneallyvaccinatedtwicewithanintervaloftwoweeksusingunfoldedandrefoldedrecombinantproteins,thenativeApx
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extractedfromtheculturalsupernatantofAPPstrainofserotype7(APP-7)andPBS,respectively.Serumantibodywasexaminedby
Apx-specificELISAtwoweeksposteveryvaccination.Twoweeksafterthesecondvaccination,micewerechallenged
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intraperitoneallywithalethaldoseofAPP-7(1.08×108CFU(colonyformunit)permouse).Theprotectionratereached91.7％inthe
nativeApxIIgroup,83.3％intherefoldedrecombinantproteingroupand58.3％inthemisfoldedrecombinantproteingroup,while
allthemiceinthePBSgroupdiedin36hpostchallenge.ThedatarevealedthattherefoldedrecombinantApxhadexcellent
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immunogenicityandcouldelicitprotectionfromthelethalchallengeofAPP.
;Apx;cloning;prokaryoticexpression;immunogenicity
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猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌急性或慢