猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核.pdf

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猪胸膜肺炎放线杆菌毒素!!基因的克隆、
序列分析及原核表达

陈汉阳刘军发何启盖肖少波陈焕春"

（华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉!"$$9$）

摘要：因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的，故参照猪胸膜肺炎放线杆血清

#型菌株的序列（J-,15,KL/#/!M）设计了一对特异性引物，用NOP的方法扩增!"#!$基因并
得到了长"!%%CB的片段，然后将其克隆到BQR8/72中，经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成
功的；再将!"#!$插入到原核表达载体B:28#7C后，转化1L#/（R:"），在SN2J诱导下获得高
效表达，经T-U@-V,C(’@@<,I检测证实表达产物有活性。以表达产物包被:LSW0板，建立了特
异、敏感的:LSW0诊断方法。
关键词：胸膜肺炎放线杆菌，毒素!0（5B6!0），克隆，原核表达
中图分类号：X97%文献标识码：0文章编号：/$$%8%/9F（#$$"）$"8$"#!8$%

猪传染性胸膜肺炎是危害当前世界各国养猪业的主要疾病之一，这种病是由胸膜肺
炎放线杆菌（$%&’()*!%’++,-"+.,/)"(.,0)(’.，0BB）引起的。目前0BB共发现有/M种血清
型［/］，并且各个国家流行的优势血清型各不相同。不同血清型之间及同一血清型的不同
菌株的毒力均存在差异，致病性也有强弱之分，从而导致该病的诊断和治疗非常困难。近
几年来的研究表明，与病原菌毒力相关的因子有毒素、荚膜、外膜蛋白、脲酶等，其中毒素
既是主要的毒力因子，也是主要的免疫原，可作为诊断抗原建立血清学检测方法，还可以
用于诊断和衡量免疫状态，因此毒素研究已成为该病研究热点。
胸膜肺炎放线杆菌共有!种毒素，即毒素"，#，!以及最近发现的毒素$，它们均属
于P2Y毒素家族。毒素"具有很强的溶血活性，毒素#相对较弱，毒素!虽没有溶血活
性，但细胞毒性较强。分泌表达上述毒素均需相邻的1、O、0、R四种基因的共同作用，其
中0基因编码毒素的结构蛋白。因此对毒素!0基因进行克隆和表达，将有助于阐明
0BB的分子致病机理，在研制新型疫苗和建立诊断方法等方面具有潜在的理论价值和应
用前景。这方面的研究国内尚未见报道。
本试验以胸膜肺炎放线杆菌血清#型标准菌株为材料，克隆鉴定了编码毒素!结构
蛋白的0基因，进行序列分析后实现了在大肠杆菌的表达，表达产物经T-U@-V,C(’@@<,I和
:LSW0证实有生物活性，现将结果报道如下。

基金项目：国家自然科学基金（"$#$$$//）；湖北省“十五”重点科技攻关项目（#$$/00#$/1$#）
"通讯作者。2-(3456：7%8#9879#7#%$7；:8;5<(：=>5+?-@AB+C(<D)E=)=C)D,
作者简介：陈汉阳（/F9FG），男，湖北人，现为华中农业大学预防兽医学专业硕士研究生。
:8;5<(：D=-,=5,H5,I#$$7AH5=’’)D’;)D,
收稿日期：#$$#8$78#%，修回日期：#$$#8/#8$#
K期陈汉阳等：猪胸膜肺炎放线杆菌毒素#!基因的克隆、序列分析及原核表达K#:

!材料和方法

!"!材料
!"!"!菌株、质粒和载体：!""血清#型，由中国农业科学院兰州兽医研究所逯忠新研究
员惠赠；"$%&’()（)&*+,-./）购自大连宝生物公司；"012+3,/4"-!56（7）、!8"#$%%9:"、
0;#’、"<)&#(=，本室保存。
!"!"#工具酶及主要试剂：限制性内切酶、<>)?@%A!聚合酶、)B%A!连接酶（)?6?C?），
%A!凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司），猪抗!""血清#型抗血清（本室自
制），9CD标记鼠抗猪EFG抗体（华美生物公司），其它试剂均为分析纯。
!"!"$培养基：;0培养基、DD;H培养基，均按常规方法配制。
!"!"%引物：根据G?I0?IJ上!""血清#型的序列（;’#’B:）设计合成（上海生工生物工程
有限公司）了一对特异性引物，扩增片段大小为KBLL="。
上游引物序列为：:MG)!N))GG)N!!GN!)G))!GNNGKM；
下游引物序列为：:M)!!NG)G))G!NN!)N!)N)NGNNKM。
!"#方法
!"#"!!""基因组的提取及DNC模板的制备：具体操作参照文献［#］进行。
!"#"#DNC反应条件：OBP预热BQ4I，OBP变性LR3，LSP复性S:3，S#P延伸’L:3，KR个循
环，最后再S#P延伸’#Q4I。
!"#"$DNC产物的鉴定及