活性氧介导三氧化二砷和Hirsutanols+A诱导肿瘤细胞自噬.pdf

中山大学

硕士学位论文

活性氧介导三氧化二砷和HirsutanolsA诱导肿瘤细胞自噬及其
在抗肿瘤中的作用

姓名：吴克伟

申请学位级别：硕士

专业：肿瘤学

指导教师：朱孝峰

20100526
业：肿瘤学活性氧介导三氧化二砷和HirsutanolsA诱导肿瘤细胞自噬及其在抗肿瘤中的作用专硕士研究生：吴克伟导师：朱孝峰研究员中文摘要作为一把“双刃剑"也在肿瘤的发生发展及防治过程中起着重要作用：一方面，一方面，多种抗肿瘤的化学药物，如环葸类抗生素、烷化剂、三氧化二砷、紫杉自噬(Autophagy)源于古代希腊语，其语源是“phagy’’(吃)与“auto”(自我)，顾名思义就是细胞的自我消化，是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的生物学过程。在提供能量、清除异常的细胞器、阻止染色体异常和维持基因组稳定性中起着重要作用。自噬还被认为是II型程序性细胞死亡，成为抗肿瘤药物直接或间接诱导细胞死亡的机制，成为抗肿瘤靶向治疗提供潜在靶点。活性氧(reactiveROS)是一类含氧的小分子活性物质，包括离子状态的超氧阴离子(02‘-)、羟根离子(OH一)及非离子状态的过氧化氢(H202)等。细胞内的ROS大部分由线粒体产生，电子从线粒体呼吸链漏出并和氧气反应生成超氧阴离子02一，随后在细胞中转变为其他形式的ROS；除此之外，NADPH氧化酶(NOX)、过氧化物酶体、脂加氧酶、和细胞色素P450氧化酶也参与细胞内ROS的产生。ROS通过对信号转导通路中的关键蛋白、转录因子及激酶结构的修饰，广泛参与细胞的生长和分化等重要的生物学活动的调节。ROS轻度升高的ROS及氧化应激可以维持肿瘤细胞恶性表型及促进肿瘤的进展；另醇和喜树碱等，都能诱导肿瘤细胞产生大量的ROS，细胞内过量的ROS堆积在中山大学硕士学位论文活性氧介导AS20，和HirsutanolsA诱导肿瘤细胞自噬及其在抗肿瘤中的作用oxygenspecies
亡的首位。由于肺癌的初期症状不明显，大部分肺癌患者在确诊肺癌时多属中晚期，致使5年生存率少于13％。因此化疗是最主要的治疗手段。多西他赛为第二析其化学结构显示该化合物具有很强的氧化作用，并且已被我们证实可以在多种A的抗肿瘤生物学活性与其能诱导细胞内的ROS的增加有关。本研究第二部分旨在研究Hirsutanols化学药物诱导肿瘤细胞死亡中起着一定的作用。三氧化二砷是传统中药砒霜中的主要成分。目前三氧化二砷已经成为急性早幼粒细胞白血病标准治疗药物，在其他实体瘤中也表现出良好的疗效。三氧化二砷的生物学活性非常广泛。目前认为三氧化二砷主要通过抑制线粒体功能、产生ROS引起氧化应激及激活多条信号通路来发挥其抗肿瘤的作用。近期也有研究发现三氧化二砷可以诱导细胞自噬。本研究第一部分旨在深入探讨ROS在三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬中作用及分子机制，阐明细胞自噬在三氧化二砷抗肿瘤效应中的作用。近年来，肺癌的发病率及死亡率逐年增加。20世纪末肺癌已占恶性肿瘤死代紫杉类药物，通过促进微管双聚体装配成微管，同时通过防止去多聚化过程而使微管稳定，阻滞细胞于G2和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖，发挥其抗肿瘤的作用，已被美国FDA批准用于非小细胞肺癌的一、二线治疗。然而同其它化疗药物一样，药物治疗后肿瘤细胞耐药性的产生却限制了其临床应用。大量肿瘤耐药机制的研究表明肿瘤耐药是多基因、多步骤综合作用的结果，是一个涉及基因突变、相关耐药蛋白及酶类的表达的复杂过程。因此必须寻找新的治疗靶点用于耐药肿瘤的治疗。随着海洋生物研究的深入，大量分子结构新颖、生物学活性独特的海洋天然产物越来越受到人们的关注。特别是“向海洋要药"理念的提出，海洋天然产物成为新药研究开发的活跃领域。其中的一些化合物已经显示出非常强的生物学活性，并进入临床前或临床研究阶段。HirsutanolsA是从南海珊瑚Sarcophytontortuosum内生菌中分离得到的一个倍半萜类化合物，分肿瘤细胞内诱导活性氧的产生并在体内显示出良好的抗肿瘤活性。进一步实验发现，HirsutanolsA对多西他赛耐药的非小细胞肺癌细胞株的影响，及ROS在HirsutanolsA药理学效应中的作用。中山大学硕士学位论文活性氧介导AS20，和HirsutanolsA诱导肿瘤细胞自噬及其在抗肿瘤中的作用
研究方法：研究结果：MTT法检测药物的细胞毒性；WestemBlot检测到LC3、p62、Caspase一3和PARP的蛋白表达；RT-PCR检测BNIP3和LC3的mRNA；共聚焦显微镜检测EYFP-LC3荧光检测自噬体的形成及p62和CathepsinsL在细胞定位。流式细胞术检测细胞内ROS的含量及溶酶体结构的完整性。用AnnexinV／PI双染色法检测凋亡。第l部分活性氧介导三氧化二砷诱导