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分子诊断在肿瘤诊断及个体化治疗中的应用与进展.pdf

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分子诊断在肿瘤诊断及个体化 治疗中的应用与进展 叶建伟 吴阶平医学基金会分子医学中心 肿瘤分子诊断策略&检测平台的综合应用 肿瘤/个体相关基因变异 染色体水平改变DNA局部变异RNA表达水平差异蛋白质表达差异 FISH未知突变已知突变实时定量PCR等IHC/ELISA 广泛分布局部突变 >20%低含量 DHPLC测序实时荧光PCR等 多层次检测平台的综合应用 分子生物学技术 ClinicalCancerResearch2007;13(17):4954-5 其他分子生物学技术：DHPLC+后荧光、突变富集PCR+DHPLC后荧光、突变富集PCR +RFLP+DHPLC后荧光、突变富集PCR+直接测序…… 细胞生物学技术：FISH、FACS 蛋白质组学技术：IHC、ELISA、蛋白质指纹图谱 不同检测水平的综合应用 中心法 则： DNA RNA 蛋白质 经典检测方法与结果示例 直接测序 •DNA提取 •PCR扩增 •测序EGFRexon19 c.2231del(CAAGGAATTAAGAGAAGC)18bp •优势：直接获取已知/未知DNA突变信息，准确可靠。金标准！ •局限性：检测肿瘤组织的DNA变异时，最高灵敏度为20%。 •适用范围：个体遗传学背景检测 大部分肿瘤组织、体液中肿瘤脱落细胞DNA变异检测 实时荧光PCRCC DNA提取T Real‐timePCR扩增 优势：快速，防污染，灵敏度极高，结果准确可靠。 局限性：仅针对已知变异。 适用范围：个体遗传学背景检测 肿瘤组织、体液中肿瘤脱落细胞、外周血游离肿瘤DNA变异测 突变富集PCR+DHPLCC 血浆游离肿瘤DNA提取 穿刺活检组织DNA提取 突变富集PCR DHPLC（+后荧光） 优势：高度灵敏（1/1000~1/10000），快速，结果准确。 局限性：仅针对已知变异。 适用范围：低含量肿瘤DNA变异监测 实时定量PCR FFPE中mRNA提取 反转录 荧光定量PCR 技术优势：快速，通量大，结果准确可靠。 局限性：样本处理及保存要求高。 适用范围：肿瘤组织中特定基因mRNA表达水平 IHC 石蜡包埋制片 免疫组化（IHC） 乳腺癌：C-erbB2（+++） 技术优势：快速，直观。 局限性：主观因素干扰，抗体来源限制。 适用范围：检测肿瘤组织相关蛋白质水平变化 ELISA 抽取外周血 酶联免疫吸附试验（ELISA） 技术优势：快速，方便。 局限性：主观因素干扰，灵敏度受限。 适用范围：检测血清中肿瘤组织分泌的蛋白标记物 FluorescenceInSituHybridization 一项快速、准确、高灵 敏度的细胞‐分子生物学 技术 在恶性肿瘤相关基因/染 色体区域的大片段缺 失、扩增、转位等方面 具有重要诊断价值 是常规分子诊断技术的 重要补充 HERHER--22扩增扩增//过表达过表达::FISHFISH NormalbreastcellsCancerbreastcells Greenprobe:chromosome17centromere Redprobe:HER2/NEUgenelocus DHPLC在分子诊断中的应用 DHPLC突变检测原理 后荧光技术 WAVE-HSDHPLCAnalysis DirectSequencing Wild‐type Control HeteroduplexesC/T 50% C/T 20% 2% 0.5% 基因芯片在肿瘤分子诊断中的应用 •DNA芯片： 遗传易感性 （P450） •表达谱芯片： 肿瘤预后和 复发评估（乳 腺癌） Stanford乳腺癌微矩阵(Perouetal.1999) 其他新技术与进展 •全基因组水平/未知基因的系统发现：高通量测序 •Solexa、SOLiD和Roche454、单分子测序等 •应用： –全基因组重测序：诊断、药物敏感性/毒性预测 –肿瘤RNASeq：基因表达分析 –肿瘤基因组计划：病因学研究 其他新技术与进展 •待测基因的深度分析：低含量突变检测技术 –突变富集 –COLD-PCR –SMAP •检测平台的扩展与延伸：分支DNA检测平台 –液相芯片检测系统 –Panomics/Affymetrix检测试剂盒 –RNAscope™：mRNA原位表达检测技术 针对不同来源标本的系统解决方案 •石蜡标本 –DNA提取：肿瘤组织体细胞突变（测序、实时荧光PCR） –RNA提取：肿瘤组织RNA表达异常（荧光定量PCR） –石蜡切片：染色体水平异常（FISH） –石蜡切片：蛋白质表达差异（IHC） •新鲜肿瘤（来源）标本 –肿瘤组织穿刺标本：肿瘤组织体细