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核酸提取及扩增技术简介(含等温扩增技术)-综述.pdf

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核酸提取及扩增技术原理简介 1核酸理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤 维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿 等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中 性或弱碱性溶液中较稳定。 2细胞破碎 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分 子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。 根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。 1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎 等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断 裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段 长度从<500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。 2）化学试剂法：经一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性 沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、 TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂 （异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。而pH环境则由加入的强碱（NaOH） 或缓冲液（TE、STE等）提供。在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂 可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA等） 螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性， 保护核酸不被降解。 3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链 酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促 进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙 酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65℃ 及有EDTA、尿素（1~4mol/L）和去污剂（0.5%SDS或1%TritonX-100）存在时 仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。 表1细胞破碎方法分类对比及运用 类别细胞破优点缺点运用 碎方法 机械高压匀大规模破碎细不适用于易造适用于酵母和大机械破碎 法浆胞的常用方法，成堵塞的团状多数细胞的破碎处理量大， 操作简单，且样或丝状真菌以破碎速度 品损失量少，间及质地坚硬的较快，时间 歇处理少量样亚细胞器，易损短，效率较 品方面效果好。伤匀浆阀高，是工业 珠磨法最有效的物理影响破碎率的适用于绝大多真规模细胞 破碎法，操作简操作参数较多菌菌丝和藻类等破碎的重 便稳定，破碎率微生物细胞的破要手段。由 可控制，易放大碎，特别是有大于机械搅 量菌丝体的微生拌产生热 物和有亚细胞器量，破碎要 的微生物细胞采用冷却 超声破操作简单，重复有效能利用率适用于多数微生措施 碎性较好，节省时低，破碎过程产物的破碎，主要 间生大量的热，大用于实验室规模 容量装置声能的细胞破碎 传递，散热均有 困难不易放大， 某些敏感性活 性物质易失活 反复冻操作简单，对于本法成本高，只适用于细胞壁较 融存在于细胞质能进行小规模脆弱的菌体，对 周围靠近细胞应用，且释放速微生物细胞作用 膜的胞内产物率慢、产量低，较差。 释放较为有效酶易失活。 低渗裂试剂便宜且易时间长，效率低 解于获取 非机化学法可以溶解细胞时间长，效率提取核酸时，常 械法（酸、或抽提胞内组低，试剂毒性较用此法，多用于 碱、表面分强，通用性差破碎细菌 活性剂 或有机 溶剂） 酶解法操作温和，选择酶的费用高，易适用于多种微生 性强，酶能快速造成产物抑制物，不适用于大 地破坏细胞壁，作用，通用性规模生产中的运 不影响细胞内差用 含物的质量，细 胞壁的损坏程 度可以控制 3传统的核酸抽提方法 传统的核酸抽提方法包括异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、碱抽提法、溴化十六 烷基三甲铵抽提法（CTAB）、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法（EtBr-CsCl）、寡聚 脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo-dT）-纤维素层析法等。 3.1异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法 酚-氯仿抽提法是核酸分离的一个经典方法。细胞裂解后离心分离含核酸的 水相，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1体积比）混合液，离心后收集 上层水相并以异丙醇沉淀其中的，乙醇漂洗掉盐分后弃去，缓冲液或蒸馏水溶解 DNA。异硫氰酸胍是一种强的蛋白变性剂，既可以破裂细胞，也可以抑制核酸 酶的作用。异硫氰酸胍用于RNA抽提由Ulrich等（1977年