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第三章大纲要求：二、教学内容基础知识+基础知识DNA加热变性基础知识融解温度（Tm）定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。DNA复性基础知识基础知识 PCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。一、PCR的原理和反应过程变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR的基本反应过程PCR的扩增效率模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
Mg2+模板DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶
dNTPs
缓冲液模板(template)耐热DNA聚合酶dNTPs镁离子浓度引物(Primer)引物设计时必须遵循的原则（6条）引物设计时必须遵循的原则PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。
根据需要，合成引物时在其5’端可以加修饰成分
如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。三、反应条件2、时间3、循环次数四、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置（二）PCR技术的质量保证（二）PCR技术的质量保证（一）目的基因的克隆
（二）基因的体外突变
（三）DNA和RNA的微量分析
（四）DNA序列测定
（五）基因突变分析第二节（一）逆转录PCR技术
（二）巢式
（三）定量PCR技术（＊＊＊＊＊）
（四）多重PCR技术
（五）PCR诱导定点突变
（六）原位PCR技术
（七）差异显示PCR技术
（X）免疫PCR技术

（一）、逆转录PCR（二）、巢式PCR（二）、巢式PCR（三）、定量PCR（四）多重PCR技术（四）多重PCR技术（四）多重PCR技术（四）多重PCR技术（五）PCR诱导定点突变（六）原位PCR技术（insituPCR）（六）原位PCR技术（insituPCR）（六）原位杂交PCR（七）差异显示PCR（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）第三节第三节PCR产物的检测一、PCR—限制性片段长度多态性RFLP的优缺点二、等位基因特异性寡核苷酸ASO的优缺点三、单链构象多态性三、单链构象多态性四、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳的优缺点Tm值的大小取决于DNA分子的长度和其序列中的G/C含量
双链DNA可以结合荧光染料（SYBRGreenI）
DNA复性时，荧光最强，随温度上升，荧光变弱，形成融点曲线。
正常序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线。
优点：
PCR产物不需要纯化，可以直接分析
可以进行大批量样本分析，成本低
结果重复性可达100%
缺点：
不能确定突变的位置PCR产物的序列分析主要用于
分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定
对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质。DNA自动测序
DNA自动测序结果举例PCR产物序列分析的优缺点PCR产物分析方法的比较拓展：PCR技术在分子诊断中的应用目前分子诊断最常见的应用：两个对照组诊断策略间接诊断策略的遗传标记（1）限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)检验流程2）可变数目串联重复和短串联重复（STR）作业