一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113354584A(43)申请公布日2021.09.07(21)申请号202110659323.1G01N21/64(2006.01)(22)申请日2021.06.15(71)申请人郑州大学地址450001河南省郑州市高新区科学大道100号(72)发明人可钰周臣张峻源孔家威刘涵博徐霞张新如岳同川赖彧商(74)专利代理机构郑州联科专利事务所(普通合伙)41104代理人时立新(51)Int.Cl.C07D221/14(2006.01)C07D471/06(2006.01)C09K11/06(2006.01)权利要求书3页说明书7页附图8页(54)发明名称荧光探针Z1、Z2对Cys作用速度快、选择强、灵敏一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光性高，可以用于细胞内半胱氨酸的检测和成像，探针及其制备方法与应用且合成方法简单，原料易得，易于推广。(57)摘要本发明属于荧光探针领域，公开了一种可区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针及其制备方法与应用，具体涉及通过氨基甲酸酯连接体将萘酰亚胺荧光发色基团和丙烯酰酯识别基团链接起来，获得检测生物硫醇的荧光探针（Z1、Z2），它们的结构如下所示：上述探针本身具有蓝色荧光，与Cys和Hcy作用后发出波长更长的黄CN113354584A绿色荧光，可以实现对Cys、Hcy、GSH的区分检测。CN113354584A权利要求书1/3页1.一种区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针，其特征在于，具有如下所示结构：或。2.合成如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针Z1的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：（1）称取对羟基苯甲醇与丙烯酰氯，以碳酸钾作为缚酸剂，丙酮和水为混合溶剂，室温下进行反应，得到中间体2；（2）将4‑硝基‑1,8‑萘二甲酸酐溶于无水乙醇，加入氯化亚锡和催化量的浓盐酸，在回流温度下进行还原，重结晶后得到中间体4；（3）将中间体4溶于无水乙醇中，加入过量的乙胺溶液，在回流搅拌下，进行脱水缩合反应，得到中间体5；（4）将上述得到的中间体5溶于无水二氯甲烷中，依次加入N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)、4‑二甲氨基吡啶（DMAP）以及三光气，冰浴条件下进行反应，最后再加入中间体2，柱色谱分离后，得到目标荧光探针Z1。3.如权利要求2所述的合成区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺类荧光探针Z1的方法，其特征在于，中间体5、三光气、DIPEA、DMAP、中间体2的摩尔比为1：1：6：0.5：1.2‑2。4.合成如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类探针Z2的合成方法，其特征在于，通过如下步骤实现：2CN113354584A权利要求书2/3页（1）首先，将4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐溶于无水乙醇中，加入乙胺溶液，在回流搅拌的条件下，进行脱水缩合反应，得到中间体7；（2）中间体7与水合肼在乙二醇单甲醚为溶剂，回流条件下，进行反应得到中间体8；（3）将中间体8溶于3‑甲基‑2‑丁酮中，加入催化量的浓硫酸，在回流状态下进行Fisher吲哚成环反应，得到中间体9；（4）中间体9溶于甲醇中，分批加入硼氢化钠，在冰浴下进行还原反应，得到化合物10；（5）将上述得到的中间体10溶于无水二氯甲烷中，依次加入N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)、4‑二甲氨基吡啶（DMAP）以及三光气，冰浴条件下进行反应，最后再加入中间体2，柱色谱分离后，得到目标荧光探针Z2；。5.如权利要求4所述的合成区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类探针Z2的方法，其特征在于，中间体10、三光气、DIPEA、DMAP、中间体2的摩尔比为1：1：6：0.5：1.2‑2。6.如权利要求1所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类荧光探针的应用，其特征在于，将其用于溶液中Cys、Hcy、GSH的区分检测或非诊断性细胞内Cys的特异成像。7.如权利要求6所述的区分Cys、Hcy和GSH的萘酰亚胺荧光类荧光探针的应用，其特征在于，所述溶液中Cys、Hcy、GSH的区分检测方法包括以下步骤：（1）用二甲基亚砜和水配置荧光探针Z1或Z2的储备液；用蒸馏水分别配置Cys、Hcy|和GSH溶液；（2）将配置好的荧光探针Z1储备液分别与Cys、Hcy和GSH溶液进行混合，使用荧光分光分度计进行波长检测，检测到Cys、Hcy在535nm处出现吸收峰，而GSH没有吸收峰；而且探针Z1对Cys的响应速度快于Hcy，据此，实现Cys、Hcy、GSH的区分检测；或将配置好的荧光探针Z2储备液分别与Cys、Hcy和GSH溶液进行混合，使用荧光分光分度计进行波长检测，检测到Cys、Hcy在565nm处出现吸收峰，而GSH没有吸