一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105886619A(43)申请公布日2016.08.24(21)申请号201610268387.8(22)申请日2016.04.27(71)申请人张梅地址050015河北省石家庄市长安区和平东路88号(72)发明人张梅(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表2页(54)发明名称一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法(57)摘要本发明提供了一种用于检测麦角菌的试剂盒，其包括引物、BstDNA聚合酶、反应缓冲液和核酸染料。本发明还提供了一种检测麦角菌的LAMP方法。使用本发明的LAMP试剂盒或方法能够快速、准确地对麦角菌进行鉴定和检测，具有高特异性、耗时短、灵敏度高、鉴定简便等优点，适于实验室或田间检验使用。CN105886619ACN105886619A权利要求书1/1页1.一种用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其特征在于，可以包括特异性引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示：外引物F3：CGGACACTCAAGATCGACC(SEQIDNO:1)外引物B3：CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQIDNO:2)内引物FIP：TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQIDNO:3)内引物BIP：GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQIDNO:4)。2.根据权利要求1所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其中所述反应缓冲液由2mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mMMg2+组成。3.根据权利要求1或2所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的用于检测麦角菌的LAMP试剂盒，其中所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液。5.一种检测麦角菌的LAMP方法，所述方法用于对食品中的麦角菌进行鉴定，其包括以下步骤：(1)向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；(2)在PCR管中制备LAMP反应体系，其包括0.2μmol/μl的外引物F31μl、0.2μmol/μl的外引物B31μl、1.2μmol/μl的内引物FIP1μl、1.2μmol/μl的内引物BIP1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的BstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水补充至25μl，并以麦角菌基因组DNA作为阳性对照，以100mMTris-HClpH8.0和50mMEDTA作为阴性对照，其中所述引物如下所示：外引物F3：CGGACACTCAAGATCGACC(SEQIDNO:1)外引物B3：CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQIDNO:2)内引物FIP：TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQIDNO:3)内引物BIP：GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQIDNO:4)；(3)将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料SYBRGreenI，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，食品中不含麦角菌，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。2CN105886619A说明书1/3页一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法。背景技术[0002]麦角菌(Clavicepspurpurea)属麦角菌科、麦角菌属，是一类主要以禾本科杂草和粮谷类植物为寄生宿主的真菌。其寄生于宿主的子房内，受侵染的子房不形成种子而是形成坚硬的菌核。菌核结构比较致密，并且外面包有一层角状外壳，由此得名“麦角”(Ergots)(Alderman,1999)。麦角菌在高湿度、高水分条件下生长旺盛，容易感染植株。大部分麦角病菌的麦角是其宿主植物种子的1-4倍。由麦角病菌及其菌核所导致宿主植物所发生的病一般称为“麦角病”(Ergotdiseases)。麦角病是麦类和禾本科植物牧草的重要病害，不但使麦类大幅度减产，而且麦角中的生物碱对人、畜有毒，历史上因误食含麦角的谷物而引起中毒事件时有发生，如牲畜误食带麦角的饲草中毒死亡，人摄入过多含麦角的谷物食品也会发生流产甚至死亡现象。因此，需要开发适于田间或实验室对麦角菌进行快速检测的试剂盒或方法。[0003]目前分子生物学检测以其快速、灵敏的特点，在微生物检测领