一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113501879A(43)申请公布日2021.10.15(21)申请号202110744676.1A61K39/00(2006.01)(22)申请日2021.06.30A61K35/768(2015.01)A61P35/00(2006.01)(71)申请人拜盖特生物科技（上海）有限公司地址201109上海市闵行区虹梅南路4999弄21号楼二层I室(72)发明人姜钰超程硕(74)专利代理机构上海申新律师事务所31272代理人郎祺(51)Int.Cl.C07K16/46(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N7/01(2006.01)A61K39/395(2006.01)权利要求书2页说明书17页序列表17页附图7页(54)发明名称一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法(57)摘要本发明提供了一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法。该双功能抗体为PD‑L1抗体可变区和TGF‑βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb‑CH3结构，包括PD‑L1抗体可变区、TGF‑βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽。本发明提供的双功能抗体设计成二硫键稳定的二价形式以增强对靶点的亲合力，具有比IgG类抗体更小的基因，能同时阻断PD‑L1和TGF‑β信号通路，可以实现低剂量高药效的效果；此外，该双功能抗体选择肿瘤高表达的PD‑L1作为靶点，使得其具有靶向富集于肿瘤微环境而不阻断非病理生理过程中TGF‑β信号的作用，提高了药物的靶向性和安全性，为治疗肿瘤提供更多高效和安全的选择。CN113501879ACN113501879A权利要求书1/2页1.一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体，其特征在于，为PD‑L1抗体可变区和TGF‑βs抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb‑CH3结构bsDHC，包括PD‑L1抗体可变区、TGF‑βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽。2.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述PD‑L1抗体可变区的制备方法包括如下步骤：步骤一，化学合成编码氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的PD‑L1基因片段、编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的人IgG1Fc基因片段，并化学合成氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的融合蛋白信号肽基因序列的引物用于表达载体构建；步骤二，将所述PD‑L1基因片段和所述人IgG1Fc基因片段进行拼接，将拼接产物克隆到pCDNA3.1质粒中，然后转染受体细胞进行培养，培养完成后收集上清，获得纯化后的重组PD‑L1‑huIgG1Fc融合蛋白；步骤三，采用所述重组PD‑L1‑huIgG1Fc融合蛋白对小鼠进行免疫获取脾脏细胞，提取cDNA；以所述cDNA为模板，采用PCR扩增提取重链可变域基因和轻链κ链可变域基因；将等量的重链可变域基因和轻链κ链可变域基因混合后为模板，通过重叠PCR扩增获得scFv基因片段；步骤四，构建scFv免疫文库并筛选获得具有阻断活性的克隆抗体并测序获得PD‑L1抗体可变区序列。3.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述PD‑L1抗体可变区包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQIDNO:4、8和12，所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQIDNO:6、10和14。4.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述连接肽选自氨基酸序列为SEQIDNO.29、31、34。5.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述TGF‑βs抗体可变区包括TGF‑β抗体的重链可变区和TGF‑β抗体的轻链可变区；所述TGF‑β抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.30，所述TGF‑β抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.32。6.根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述人IgG1的铰链结构域的氨基酸序列为SEQIDNO.33；所述人IgG1的CH3结构域的氨基酸序列为SEQIDNO.35。7.如权利要求1‑6任一项所述双功能抗体的制备方法，其特征在于，合成PD‑L1抗体可变区、TGF‑βs抗体可变区、可产生二硫键的人IgG1的铰链结构域、人IgG1的CH3结构域和连接肽，然后通过化学合成的方式合成所述双功能抗体bsDHC。8.如权利要求1‑6任一项所述双功能抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。9.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括如权利要求1‑6任一项所述双功能抗体，并将其作为活性成分。10.一种表达