一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113717985A(43)申请公布日2021.11.30(21)申请号202110964847.1(22)申请日2021.08.23(71)申请人南开大学地址300071天津市南开区卫津路94号(72)发明人王春国李慧陈成彬(74)专利代理机构天津市杰盈专利代理有限公司12207代理人朱红星(51)Int.Cl.C12N15/56(2006.01)C12N9/24(2006.01)C12N15/84(2006.01)C12N15/11(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/20(2018.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图2页(54)发明名称一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用(57)摘要本发明公开一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，及利用该方法培育青花菜新品种的应用，它包括如下步骤：黑芥子酶基因bolmyr‑01编码序列合成；带酶切位点bolmyr‑01扩增；过表达载体构建；遗传转化；过表达bolmyr‑01青花菜阳性株系筛选；过表达bolmyr‑01青花菜自交纯合；过表达bolmyr‑01青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及农艺性状评价。结果显示，相同生长条件下，在青花菜不同种质材料中过表达bolmyr‑01不影响花球形状、产量，但可显著提高种质材料中萝卜硫素的含量。过表达bolmyr‑01青花菜种质材料中萝卜硫素的含量可达到对照的5‑10倍。本发明公开的方法，对于高效、快速、定向的进行青花菜新种质创制，丰富青花菜种质资源，培育青花菜新品种具有重要价值。CN113717985ACN113717985A权利要求书1/1页1.一种黑芥子基因bolmyr‑01编码序列，具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.一种利用权利要求1所述基因编码序列创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）黑芥子酶基因bolmyr‑01的合成：经过序列优化的黑芥子酶基因bolmyr‑01编码序列SEQIDNO：1，合成序列溶于50μL无菌水中，终浓度为200ng/μL；（2）带酶切位点黑芥子酶基因bolmyr‑01扩增：利用带有NcoI和BstEII酶切位点序列的引物bolmyr‑01‑F和bolmyr‑01‑R，以所述合成的序列为模板进行PCR扩增，获得带有酶切位点的bolmyr‑01编码序列；bolmyr‑01‑F引物，由序列5’AACACGGGGGACTCTTGACCATGGATGAAGCTTCTTCTTCATGGACTCGC3’组成，SEQIDNO：2；bolmyr‑01‑R引物，由序列5’ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’组成，SEQIDNO：3；（3）黑芥子酶基因bolmyr‑01过表达载体构建；（4）黑芥子酶基因bolmyr‑01过表达载体遗传转化青花菜；（5）过表达黑芥子酶基因bolmyr‑01青花菜阳性株系筛选；（6）过表达黑芥子酶青花菜自交纯合；（7）过表达黑芥子酶青花菜纯合系萝卜硫素含量测定及综合农艺性状评价。3.一种利用权利要求2所述创制高萝卜硫素含量青花菜新种质方法的应用，其中创制高萝卜硫素含量青花菜新种质方法的应用指的是利用创制的新种质，采用杂交育种方法进行高萝卜硫素青花菜新品种的培育。4.权利要求2中所述扩增黑芥子酶基因bolmyr‑01带酶切位点的引物序列bolmyr‑01‑F：5’ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’；bolmyr‑01‑R：5’ATCGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’。2CN113717985A说明书1/9页一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法及应用技术领域[0001]本发明涉及生物育种领域中一种创制高萝卜硫素含量青花菜新种质的方法，及其在培育高萝卜硫素含量青花菜新品种中的应用。背景技术[0002]青花菜，又名西兰花、罗马花椰菜，是十字花科芸苔属甘蓝种的一个变种，其营养丰富，素有“蔬菜皇冠”的美誉，是我国常见的大宗蔬菜种类之一。大量的研究表明，青花菜中富含生物活性物质萝卜硫素（Sulforaphane，SFN）。萝卜硫素是十字花科植物所含硫苷水解后的一种小分子异硫氰酸盐，分子式为C6H11NOS2，具有C=N=S结构，相对分子质量为177.29。萝卜硫素在高纯度状态下为黄色油状液体，易溶解在乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂，不易溶于水。体内外实验表明，萝卜硫素可以预防及治疗各种癌症、降低心血管疾病的风险，并有助于治疗自闭症和糖尿病，是目前蔬菜中发现的抗癌活性最强的物