基因工程操作的工具酶.ppt

第二章基因工程操作的工具酶2.1基因工程工具酶1.工具酶的概念
2.限制性内切酶
3.DNA聚合酶
4DNA连接酶
5.碱性磷酸酶
6末端转移酶
7核酸酶S1
8T4多核苷酸激酶1.工具酶的概念

应用与基因工程的各种酶的总称.
切:
连:
修饰:2.限制性内切酶限制性内切酶的发现限制性内切酶的定义限制性内切酶分类Ⅱ型限制性内切酶：
3个基本的特征：
①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp,识别位点经常是一种回文序列的DNA.

限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷酸，这些序列大多呈回纹结构。

EcoRⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子。
5’…G↓A–A-T–T–C…3’
3’…C–T–T–A–A↑G…5’
PstⅠ酶切
5’…C–T–G–C–A↓G…3’
3’…G↑A–C–G–T–C…5’

SmaⅠ酶切
5’…C–C–C↓G–G–G…3’
3’…G–G–G↑C–C–C…5’

限制性核酸内切酶的命名常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点
EcoRⅠG↓AATTC
HindⅡGTPy↓PuAC
HindⅢA↓AGCTT
BsuRIGG↓CC限制酶产生末端的连接b、不匹配末端连接C.平末端连接内切酶的切割方式核酸内切酶的缓冲液性质大肠杆菌中的甲基化酶
dam甲基化酶:可在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。
dcm甲基化酶
此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII。3’－腺嘌呤脱氧核苷酸N甲基化酶在基因工程中用途:

许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件应注意的问题影响限制性核酸内切酶活性的因素3.DNA聚合酶DNA聚合酶(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，Klenow片段或K1enow聚合酶。只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’--3’外切酶活性。
具有5’—3’聚合酶活性；
3’—5’外切酶活性。
(3)TaqDNA聚合酶(4)逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）
AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）,
M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）。
AMV逆转录酶反应的最适温度为41～45℃，最适pH为8.3。
T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶测序酶4.DNA连接酶DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl50-100mM,pH7.5
MgCl210mM,ATP0.5-1mM,DTT5mM
Volume:10-20µl
TT:4-15℃,4-16hr
1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,15℃反应1小时，完全连接1µgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量.平头双链DNA片段的连接操作

粘性末端的连接属于分子内部的连接.

平头末端的连接属于分子间的连接，反应速度慢.

5.碱性磷酸酶分类：
（1）BAP(bacterialalkalinephosphatase）:细菌碱性磷酸酶，来源于大肠杆菌。
活性高，但耐高温和去污剂，抑制其活性较难。
（2）CIP（calfintestinalalkalinephosphatase）:牛小肠碱性磷酸酶，来源于小牛肠。
蛋白酶K消化，EDTA参与下，65℃加热1小时灭活。

6.末端转移酶7.核酸酶S1S1核酸酶降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。需要辅助因子Zn。

用途：
(1)去除DNA片断中突出的单链尾以产生平端。
(2)打开双链cDNA合成中产生的发夹。
带切口的双链DNA

S1核酸酶8.T4噬菌体多核苷酸激酶

催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5’末端。
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。
9.DNaseⅠ10.核糖核酸酶A5’pApGpCpCpGpApApUpGpCpApG3’

5’pApGpCp＋Cp＋GpApApUp＋GpCp

＋ApG
RNaseU211.核糖核酸酶T15’pApGpGpCpCpGpApApGpUpGpCpApGpC

5’pApGp＋Gp＋CpCpGp＋ApApGp＋UpGp＋CpApGp＋C

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