基因工程基因操作的工具酶.pptx

3.3DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。

反应特点：
(1)以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物
(2)反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定
(3)聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH游离基团
(4)DNA链的生长方向为5’3’
(5)产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。

种类：
到目前为止，已从E.coli中发现了PolI、PolII、PolIII三种DNA聚合酶。其中PolI和PolII的主要功能是参与DNA的修复过程，PolIII与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有PolI同分子克隆关系密切。3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNAPolI）

DNAPolI是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65Å
DNAPolI已得到高度纯化，从100kg大肠杆菌中可以分离到约500mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的PolI。1.DNAPolI在空间结构上有三个位点：

(1) DNA模板结合位点——结合模板
(2) 核苷酸-磷酸结合位点——结合引物
(3) dNTP结合位点——结合底物
2.DNAPolI是一种多功能酶：
(1)5’3’的聚合酶活性
催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3’-OH末端，沿着引物的3’-OH方向按模板顺序从5’3’延伸。

每分子DNApolI每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。(2)5’3’的外切酶活性
只作用于双链DNA（dsDNA），从5’端切割下一个个单核苷酸。
(3)3’5’的外切酶活性
能从游离的3’末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。

在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3’5’外切酶活性受到5’3’聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3’5’外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3’5’核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。
3.E.coliDNAPolI在基因工程中的用途:
(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组
(2)用于DNA序列分析
(3)用于制备DNA探针

在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5’一侧的核苷酸不断地被移去，3’一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动——缺口平移（NickTranslation）。应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25l总体积中含有1g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseI、polI、32PdNTP和未标记的dNTP。

脱氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸末端的单（寡）核苷酸。
由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP。

改变反应体系中DNaseI的数量，可以控制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链。3.3.2大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段
（E.coliDNAPolIKlenowfragment）

用蛋白酶将DNAPolI作有限水解，可得到分子量为75000dal和36000dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5’3’的核酸外切酶活性。

Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5’延伸末端）。
对于限制性核酸内切酶EcoRI切割后形成的5’延伸末端可用32PdATP标记：

而BamHI切割后形成的5’延伸末端可用32PdGTP标记：

3.3.3T4DNA聚合酶
是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶。
1.T4DNA聚合酶也是一种多功能酶：
(1)5’3’的聚合酶活性
(2)3’5’的外切酶活性
其外切酶活性比E.coliDNAPolI的活性高200倍。