一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113671194A(43)申请公布日2021.11.19(21)申请号202110965416.7(22)申请日2021.08.23(71)申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人周静靳锴左其生李碧春(74)专利代理机构扬州苏中专利事务所(普通合伙)32222代理人沈志海(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图4页(54)发明名称一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法(57)摘要本发明涉及一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法，本方法适用于建立4.5d鸡胚生殖嵴的cDNA文库，筛选已知基因的互作蛋白。可大量捕捉获得和PGCs形成相关的转录因子，完善相应的信号通路，绘制PGCs的形成调控网络，为大量体外诱导获取PGCs奠定实验数据和理论基础。该方法成本低、易操作、高通量、可达到全基因组水平，弥补了其他探讨蛋白互作方式的不准确性和不全面性，为后期深入探究新蛋白的功能、研究蛋白与蛋白的互作依赖关系等进行铺垫。适用于建立4.5d鸡胚生殖嵴的cDNA文库，筛选已知基因的互作蛋白。采用本方法，可大量捕捉获得和PGCs形成相关的转录因子，完善相应的信号通路，绘制PGCs的形成调控网络，为大量体外诱导获取PGCs奠定实验数据和理论基础。CN113671194ACN113671194A权利要求书1/1页1.一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）提取4.5天鸡胚PGCsRNA并纯化，反转录合成cDNA的第一条链，即单链cDNA；（2）利用DNA聚合酶，对单链cDNA进行PCR扩增合成dscDNA，电泳检测后对其再纯化提取；（3）将cDNA序列连接至线性化的pGADT7载体中，转化到Y187酵母感受态细胞以构建猎物载体pGADT7‑cDNA，通过检测猎物载体pGADT7‑cDNA后对其进行质量鉴定；（4）将C2EIP基因扩增、切胶回收后连接至PGBKT7载体中，转化到Y2HGold酵母感受态细胞以构建诱饵载体PGBKT7‑C2EIP，将猎物空载和诱饵载体共转化Y2HGold酵母菌株进行毒性检测和自激活检测；（5）猎物质粒与诱饵质粒混合接种在2×YPDA液体培养基，镜检结合生长子产生情况，涂布TDO/X平板培养后挑选所有蓝斑克隆接种于QDO/X平板上，选择阳性菌落菌检PCR并测序。2.根据权利要求1所述的一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法，其特征是，步骤（3）中，检测猎物载体pGADT7‑cDNA的内容包括cDNA文库滴度、阳性率、插入片段。2CN113671194A说明书1/5页一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法技术领域[0001]本发明涉及一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法，属于生物技术领域。技术背景[0002]酵母双杂交系统是研究蛋白之间相互作用的一种常见分子生物学技术，可将已知蛋白(诱饵蛋白)融合DNA结合结构域产生的重组载体BD－Bait，和未知蛋白(捕获蛋白)融合转录激活结构域产生的重组载体AD－Prey相结合，通过观察报告基因的激活表达以此筛选相结合的互作蛋白。对研究新蛋白质、探究蛋白质功能、了解代谢调控与信号传导、靶向治疗和研究人类与动物的DNA文库等方面有着广泛应用。2014年，BenoitJ等对小鼠大脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选发现外周蛋白Per‑61存在新的外周蛋白相互作用物，并对囊泡运输、信号转导、DNA/RNA处理、蛋白质折叠和线粒体代谢等生物学过程发挥作用。而在家禽上，原始生殖细胞(Primordialgermcells，PGCs)作为精卵发育的祖先细胞，受多因素调控，但其产生及发育分化的具体机制尚不明晰，需探究和其调控相关的关键基因、转录因子、信号通路等之间的详细相互作用，酵母双杂交技术的介入与应用为日后有效解决鸡PGCs形成机制、构建调控网络、扩大PGCs生产等关键性问题提供了良好的科研思路。同时，该技术是在活细胞中进行测定，避免了免疫共沉淀、交联、亲和层析等其他验证蛋白互作方法所存在的受外界因素干扰的情况，而且也对瞬时存在的和不稳定的蛋白有着较好的检测效果。因此，通过酵母双杂交系统探索蛋白互作网络将为剖析鸡PGCs形成机制、大批量生产鸡胚PGCs细胞提供更多的技术支撑，为家禽细胞和胚胎工程研究提供更多的实验材料。发明内容[0003]本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供一种筛选鸡目的蛋白互作转录因子的方法，该方法成本低、易操作、高通量、可达到全基因组水平，弥补了其他探讨蛋白互作方式的不准确性和不全面性，为后期深入探究新蛋白的功能、研究蛋白与蛋白的互作依赖关系等进行铺垫。[0004]本发明的目的是这样实现的：一种筛选鸡目的蛋