一种基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115948414A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211187647.0(22)申请日2022.09.28(71)申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市长江西路130号(72)发明人蔡永萍张蓥杰王涵周欣月周祺芳(74)专利代理机构合肥兴东知识产权代理有限公司34148专利代理师王伟(51)Int.Cl.C12N15/29(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N1/16(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书3页说明书12页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法(57)摘要本发明提供了一种基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法，包括如下步骤：获取梨石细胞负调控转录因子；构建重组文库载体；通过同源重组将筛选的梨石细胞负调控转录因子基因连接到pGBKT7载体，形成“重组诱饵载体”；自激活验证；酵母双杂交文库筛选；阳性鉴定；筛选并确定目的序列；点对点阳性验证，如菌落变为蓝色则说明阳性验证成功，蓝色的深浅反映互作能力强弱。本发明方法可快速筛选出与梨石细胞抑制转录因子相互作用的蛋白质、并鉴定其可能的生物学功能，还可以判断出梨石细胞抑制转录因子与互作蛋白的相互作用强弱，为改善梨果实石细胞含量，提高果实口感提供分子生物学基础。CN115948414ACN115948414A权利要求书1/3页1.一种基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、获取梨石细胞负调控转录因子：基于转录组数据，筛选得到梨石细胞负调控转录因子；S2、构建重组文库载体：获得砀山酥梨果实的cDNA文库，并将其连接到pGADT7载体，获得“重组文库载体”；S3、构建重组诱饵载体：通过同源重组将步骤S1筛选的梨石细胞负调控转录因子基因连接到pGBKT7载体，形成“重组诱饵载体”；S4、自激活验证：将构建好的“重组诱饵载体”与“空载pGADT7”共转化酵母感受态细胞Y2HGold，且分别涂布于二缺板、三缺板和四缺板上；根据各缺性板上菌落的生长情况，确定供后续酵母双杂交文库筛选使用的DCPY；S5、酵母双杂交文库筛选：将“重组诱饵载体”与“重组文库载体”共转化酵母感受态Y2HGold；取X‑α‑Gal二甲基甲酰胺溶液涂布于筛选的DCPY上，再涂布酵母菌体进行培养；待酵母菌落生长至一定大小，挑取蓝色菌落进行阳性鉴定；S6、阳性鉴定：挑取蓝色阳性酵母菌落，加入KOH溶液后进行预热处理；取预热后的菌液作为模板进行菌落阳性PCR鉴定，将出现阳性条带的菌液送样测序；S7、筛选并确定目的序列：将测序结果与砀山酥梨的基因组进行blast比对，确定与梨石细胞抑制转录因子相互作用蛋白质的基因序列，并通过生物信息学分析推测生物学功能；选择目的序列进行克隆；S8、点对点阳性验证：将目的序列通过同源重组连接到pGADT7载体，形成“重组目的序列质粒”；将“重组诱饵质粒”与“重组目的序列质粒”共转化酵母感受态Y2HGold，并涂布于筛选的DCPY上培养；挑取阳性菌制成菌液，同时，取X‑α‑Gal二甲基甲酰胺溶液涂布于筛选的DCPY上，再将全部菌液滴在平板培养基表面；如菌落变为蓝色则说明阳性验证成功，蓝色的深浅反映互作能力强弱。2.根据权利要求1所述的基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S1中，筛选到的梨石细胞负调控转录因子为PbMYB80，其基因序列如SEQIDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S2中，“重组文库载体”的具体构建方法为：选取花后39d的砀山酥梨果实去除果皮和果核，称取果肉100mg，做好标记；使用植物RNA提取试剂盒提取RNA，使用DynabeadsTMmRNA纯化试剂盒对总RNA提纯；以提纯后的mRNA为模板，使用CloneMinerTMIIcDNALibraryConstructionKit克隆至pDONR222载体上形成初级文库载体，电转化大肠杆菌DH10B菌株，挑取阳性克隆PCR鉴定，将阳性菌落挑于LB液体培养基30℃过夜培养，抽提质粒，测定OD值并电泳检测；2CN115948414A权利要求书2/3页将阳性质粒稀释到200～400ng/μL，通过LR重组反应连接到pGADT7载体，构建获得“重组文库载体”。4.根据权利要求1所述的基于Y2H筛选梨石细胞负调控因子互作蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述二缺板为“‑Leu/‑Trp”缺性板，三缺板为“‑His/