新型冠状病毒一步法磁珠核酸检测试剂盒及其使用方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113736914A(43)申请公布日2021.12.03(21)申请号202010471343.1(22)申请日2020.05.29(71)申请人绍兴迅敏康生物科技有限公司地址312000浙江省绍兴市越城区群贤路口与中兴大道东南角五楼503室(72)发明人王一芳周紫燕陶施芳李子钦潘玲玲寿海浩(74)专利代理机构杭州天昊专利代理事务所(特殊普通合伙)33283代理人向庆宁(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12Q1/6806(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书15页(54)发明名称新型冠状病毒一步法磁珠核酸检测试剂盒及其使用方法(57)摘要本发明提供了一种新型冠状病毒的一步法磁珠核酸提取检测试剂盒及其使用方法，通过一步法磁珠核酸提取两个特异性目标基因序列2019nCoV1和2019nCoV2的核酸序列并进行检测，实现对新型冠状病毒的精准检测，整个检测时长不超过90min，省时高效。本发明提供的检测试剂盒能保持较好的检测灵敏度和特异性，采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，不需要对磁珠洗涤，直接用磁珠和扩增的试剂接触进行核酸的扩增，减少了操作步骤，同时避免了杂质对检测的干扰；要求的样本量少，20-30ul或者更少就可实现；简化了操作，可以实现自动化的平台进行操作。CN113736914ACN113736914A权利要求书1/2页1.一种新型冠状病毒的一步法磁珠核酸提取检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸裂解液、包含羟基磁珠的磁珠悬浮液，和包含三组引物和探针的定量PCR检测液，其中，第一组为：对应于2019nCoV1的上游引物的序列如序列表中SeqIDNO.1所示；对应于2019nCoV1的下游引物的序列如序列表中SeqIDNO.2所示；对应于2019nCoV1的TAQMAN探针的序列如序列表中SeqIDNO.3所示；其扩增产物2019nCoV1的序列如序列表中SeqIDNO.4所示；第二组为：对应于2019nCoV2的上游引物的序列如序列表中SeqIDNO.5所示；对应于2019nCoV2的下游引物的序列如序列表中SeqIDNO.6所示；对应于2019nCoV2的TAQMAN探针的序列如序列表中SeqIDNO.7所示；其扩增产物2019nCoV2的序列如序列表中SeqIDNO.8所示。第三组为内标引物和探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的第三组内标引物和探针为：对应于MS2的上游引物的序列如序列表中SeqIDNO.9所示；对应于MS2的下游引物的序列如序列表中SeqIDNO.10所示；对应于MS2的TAQMAN探针的序列如序列表中SeqIDNO.11所示；所述的MS2的序列如序列表中SeqIDNO.12所示。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述TAQMAN探针还包括荧光基因和荧光淬灭基因，其中第一组和第二组TAQMAN探针的荧光基因为FAM，荧光淬灭基因为BHQ1，第三组TAQMAN探针的荧光基因为Cy5，荧光淬灭基因为BHQ1。4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸裂解溶液包括1MNaCl、0.01％Triton-X和0.001MKCl；所述磁珠悬浮液包括羟基修饰的磁珠，多分散系数＜0.2，直径小于或等于500nm，含量为10mg/mL。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸裂解液和磁珠悬浮液的体积比为200:1。6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应扩增试剂还包括PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶和逆转录酶，以及去核酸水。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR缓冲液包括1～10mmol/L的Mg2+，10～50mmol/L的Tris–HCl缓冲液，50～1000umol/L的dNTP，25mmol/L的K离子，100μg/ml的酶稳定性试剂。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR缓冲液包括1.5mmol/L的Mg2+，10～50mmol/L的Tris–HCl缓冲液，200umol/L的dNTP，25mmol/L的KCl，100μg/ml的BSA或非离子型去垢剂，0.3％的甘油。9.用于检测靶序列2019nCoV1和2019nCoV2组合的检测试剂在制备2019新型冠状病毒一步法磁珠核酸提取检测试剂盒中的用途。10.一种利用如权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行一步法磁珠核酸提取检测样本中新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：2CN113736914A权利要求书2/2页(1)核酸裂解液、羟基磁珠悬浮液混合成磁珠裂解液，取20-3