用于改进的基因编辑的组合物和方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113748205A(43)申请公布日2021.12.03(21)申请号202080027721.5(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公(22)申请日2020.04.09司72001代理人李波初明明(30)优先权数据62/8334042019.04.12US(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2021.10.09(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2020/0602502020.04.09(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/208185EN2020.10.15(71)申请人阿斯利康（瑞典）有限公司地址瑞典南泰利耶(72)发明人M·马雷斯卡S·李权利要求书8页说明书80页附图63页(54)发明名称用于改进的基因编辑的组合物和方法(57)摘要本披露提供了在靶细胞中引入位点特异性突变的方法和确定能够引入位点特异性突变的酶的功效的方法。本披露还提供了提供双等位基因序列整合的方法，将目标序列整合到细胞基因组中的基因座中的方法，以及在细胞中引入稳定的附加型载体的方法。本披露进一步提供了产生对白喉毒素有抗性的人类细胞的方法。CN113748205ACN113748205A权利要求书1/8页1.一种在细胞群体中的靶细胞中的靶多核苷酸中引入位点特异性突变的方法，该方法包括：(a)向该细胞群体中引入：(i)碱基编辑酶；(ii)第一向导多核苷酸，该第一向导多核苷酸(1)与编码细胞毒性剂(CA)受体的基因杂交，并且(2)与该碱基编辑酶形成第一复合物，其中该第一复合物的该碱基编辑酶在该编码CA受体的基因中提供突变，并且其中该编码CA受体的基因中的该突变在该细胞群体中形成CA抗性细胞；以及(iii)第二向导多核苷酸，该第二向导多核苷酸(1)与该靶多核苷酸杂交，并且(2)与该碱基编辑酶形成第二复合物，其中该第二复合物的该碱基编辑酶在该靶多核苷酸中提供突变；(b)使该细胞群体与该CA接触；以及(c)从该细胞群体中选择该CA抗性细胞，从而富集在该靶多核苷酸中包含该突变的靶细胞。2.一种确定碱基编辑酶在细胞群体中的功效的方法，该方法包括：(a)向该细胞群体中引入：(i)碱基编辑酶；(ii)第一向导多核苷酸，该第一向导多核苷酸(1)与编码细胞毒性剂(CA)受体的基因杂交，并且(2)与该碱基编辑酶形成第一复合物，其中该第一复合物的该碱基编辑酶在该编码CA受体的基因中引入突变，并且其中该编码CA受体的基因中的该突变在该细胞群体中形成CA抗性细胞；以及(iii)第二向导多核苷酸，该第二向导多核苷酸(1)与该靶多核苷酸杂交，并且(2)与该碱基编辑酶形成第二复合物，其中该第二复合物的该碱基编辑酶在该靶多核苷酸中引入突变；(b)使该细胞群体与该CA接触以分离CA抗性细胞；以及(c)通过确定这些CA抗性细胞与总细胞群体的比率来确定该碱基编辑酶的功效。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该碱基编辑酶包含DNA靶向结构域和DNA编辑结构域。4.如权利要求3所述的方法，其中该DNA靶向结构域包含Cas9。5.如权利要求4所述的方法，其中该Cas9在催化结构域中包含突变。6.如权利要求1‑5中任一项所述的方法，其中该碱基编辑酶包含无催化活性的Cas9和DNA编辑结构域。7.如权利要求1‑5中任一项所述的方法，其中该碱基编辑酶包含能够产生单链DNA断裂的Cas9(nCas9)和DNA编辑结构域。8.如权利要求7所述的方法，其中该nCas9相对于野生型Cas9在氨基酸残基D10或H8402CN113748205A权利要求书2/8页处包含突变(相对于SEQIDNO：3编号)。9.如权利要求4‑8中任一项所述的方法，其中该Cas9与SEQIDNO：3或4具有至少90％同一性。10.如权利要求3‑9中任一项所述的方法，其中该DNA编辑结构域包含脱氨酶。11.如权利要求10所述的方法，其中该脱氨酶是胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。12.如权利要求11所述的方法，其中该脱氨酶是胞苷脱氨酶。13.如权利要求11所述的方法，其中该脱氨酶是腺苷脱氨酶。14.如权利要求10‑13中任一项所述的方法，其中该脱氨酶是载脂蛋白BmRNA编辑复合物(APOBEC)脱氨酶、活化诱导性胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT脱氨酶或ADAR脱氨酶。15.如权利要求14所述的方法，其中该脱氨酶是载脂蛋白BmRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。16.如权利要求15所述的方法，其中该脱氨酶是APOBEC1。17.如权利要求3‑16中任一项所述的方法，其中该碱基编辑酶进一步包含DNA糖基化酶抑制剂结构域。18.如权利要求17所述的方法，其中该DNA糖基