一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113755471A(43)申请公布日2021.12.07(21)申请号202111004819.1C12P19/00(2006.01)(22)申请日2021.08.30C12R1/19(2006.01)(71)申请人常州大学地址213164江苏省常州市武进区湖塘镇滆湖中路21号(72)发明人郭静满在伟杜昌阳蔡志强(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人殷星(51)Int.Cl.C12N9/24(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12P19/14(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表12页附图2页(54)发明名称一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了一种壳聚糖酶突变体和工程菌及应用，属于酶工程技术领域。其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的壳聚糖酶第121位脯氨酸突变为天冬酰胺或半胱氨酸或缬氨酸。本发明壳聚糖酶突变体与野生型壳聚糖酶相比，三种突变体催化胶体壳聚糖获得壳寡糖的比酶活分别提高1.69、1.97及2.15倍，特别是P121N突变体，提高催化活性的同时，没有损失热稳定性，具备良好的应用前景；本发明还提供一种上述突变体的构建方法，通过分析该酶蛋白结构上的高去折叠自由能位点，以此选取突变位点，采用基因工程方法对该位点进行饱和突变，然后筛选目的蛋白。CN113755471ACN113755471A权利要求书1/1页1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体为枯草芽孢杆菌壳聚糖酶发生点突变后形成的具有催化产壳寡糖功能的突变体，所述突变位置为编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的核苷酸序列上第121位脯氨酸进行定点突变；所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的核苷酸序列为SEQIDNO:2。3.根据权利要求1所述的壳聚糖酶突变体，其特征在于，当所述第121位脯氨酸突变为天冬酰胺时，壳聚糖酶突变体记为P121N；所述第121位脯氨酸突变为半胱氨酸时，壳聚糖酶突变体记为P121C；所述第121位脯氨酸突变为缬氨酸时，壳聚糖酶突变体记为P121V。4.根据权利要求3所述的根据权利要求1所述的壳聚糖酶突变体，其特征在于，壳聚糖酶突变体P121N的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述壳聚糖酶突变体P121C的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述壳聚糖酶突变体P121V的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。5.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求3所述的壳聚糖酶突变体。6.一种重组载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有权利要求3所述的壳聚糖酶突变体或权利要求5所述的基因。7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌为转化/转染权利要求6所述的重组载体的宿主菌。8.基于权利要求1所述的壳聚糖酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主携带的壳聚糖酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，及逆行反向PCR，扩增突变质粒全长；使用DpnI限制性内切酶消化模板质粒；将经过DpnI限制性内切酶处理的PCR产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB平板过夜培养；挑取单菌落接种至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，过夜培养后提取质粒并进行测序验证；将测序结果正确的质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，即得壳聚糖酶突变体。9.基于权利要求1‑4或权利要求8中任一项所述的壳聚糖酶突变体在催化产壳寡糖上的应用。2CN113755471A说明书1/10页一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用。背景技术[0002]壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是一类可以水解壳聚糖产壳寡糖或氨基葡萄糖的糖苷酶。根据糖苷酶数据库中特征氨基酸序列的差异，壳聚糖酶主要分布于GH8、GH46、GH75和GH80家族，其中以GH46家族壳聚糖酶的研究最为深入。GH46家族壳聚糖酶呈哑铃型，由α螺旋连接两个大小不同的球体，活性中心有两个催化残基Asp和Glu，一个氨基酸残基作为亲核试剂，另一个作为广义酸/碱。[0003]壳聚糖，又称脱乙酰甲壳素，是以氨基葡萄糖为单体通过β‑1.4‑糖苷键连接而成的线性高聚物，广泛的存在于各类节肢动物(虾、蟹)的外壳和某些真菌与藻类的细胞壁中。每年通过生物合成的壳聚糖接近100亿吨，是含量仅次于纤维素可再生多糖。壳聚糖经降解可生成壳寡糖(聚合