青霉素发酵效价的生物学测定.docx

青霉素发酵效价的生物学测定一、实验目的1、了解青霉素作用的机理2、了解青霉素效价的生物学测定的原理3、掌握管碟法测量抗生素效价的方法4、掌握青霉素摇瓶培养的操作流程二、实验原理（一）、青霉素及作用的机理抗生素：是某些微生物在其代谢过程中所产生的能抑制或杀灭其他病原微生物的化学物质；是细菌、真菌、放线菌等微生物的代谢产物。主要从微生物的培养液中提取能杀死或抑制其他病原微生物。在低浓度即可对某些生物的生命活动有特异一直作用的化学物质的总称。2.青霉素天然青霉素系从青霉菌的培养液中提取获得主要含有：青霉素F、G、X、K和双氢F五种。其中以青霉素G(又名苄青霉素)的作用最强性质较稳定产量亦较高。青霉素G的结构：青霉素钾、钠的结构：青霉素钾盐、钠盐的性质：遇酸、碱或氧化剂等迅速失效。有引湿性；在水中极易溶解乙醇中溶解在脂肪油或液状石蜡中不溶。水溶液在室温放置易失效；20万IU/ml青霉素溶液于30℃放置24h效价下降56%青霉烯酸含量增加200倍临床应用时要新鲜配制。（所以只有粉制剂没有注射液用时用注射用水稀释；如使用不完放置不要过久）。3.青霉素作用机理使细菌细胞壁缺损(黏肽)菌体内的高渗透压使细胞外面的水分不断地渗入菌体内引起菌体膨胀变形加上激活自溶酶使细菌裂解而死亡.G+(二)青霉素效价的生物学测定的原理1.效价:是评价抗生素效能的标准也是衡量抗生素活性成分含量的尺度微生物鉴定法：以抗生素对微生物的杀伤力或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的方法理化方法：根据抗生素的结构特点利用其特有的化学或物理性质及反应而进行的抗生素活性表示方法：抗生素的活性以效价单位来表示;每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少用单位u表示一个青霉素效价单位：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌发育的最小青霉素剂量;以IU表示1mg青霉素G钠盐定为1667单位；1mg青霉素G钾盐为1595单位(三)管碟法测量抗生素效价的方法1.利用抗生素在培养基内的扩散渗透作用将已知效价的标准品溶液与未知效价的被检品溶液在同样条件下加入已放置在含有高度敏感性的试验菌的培养基上的小管内2.培养后在抗生素扩散到达的适当范围内产生了透明的抑菌圈。不同浓度的抗生素抑菌圈的大小不同；比较标准品与检品的抑菌圈大小利用不同的计算原理就可以推算出此抗菌素的效价(四)青霉素摇瓶培养的操作流程1.菌种活化:从保藏菌种接种到灭菌的斜面培养基中25℃培养6-7天;待斜面上长满菌苔后作为以及菌种制备的起始菌株2.一级斜面菌种制作:从起始菌株斜面接种到灭菌的斜面培养基25℃培养6-7天如无杂菌污染及为一级斜面菌种3.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基25℃、200rpm培养6-7天可进行青霉素的效价测定等4.发酵罐培养:流程：冷冻管→斜面母瓶（1）→大米孢子（2）→一级种子罐（3）→二级种子罐（4）→发酵罐（5）→放罐至提炼各步所需培养条件：1.25℃6—7天；2.25℃6—7天；3.25℃40—45h1：2VVM(每分钟通气体积比)4.25℃13—15h1：1.5VVM;5.22-26℃6—7天1：1—0.8VVM。三.实验材料1.菌种产黄青霉菌(Pentcilliumchrysogenum)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusauoreus)2.药品青霉素钠0.2mol/LpH6.0磷酸缓冲液0.85%生理盐水发酵培养基生物测定培养基3.仪器及器皿移液枪无菌枪头接种环酒精灯烧杯培养皿滴管试管超净工作台等四.操作步骤1.发酵培养基的配制:按照配方配制液体培养基250ml三角瓶装液量为100ml。2.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基25℃、200rpm培养6-7天可进行青霉素的效价测定3.青霉素标准溶液的配制:准确称取纯苄青霉素钠0.06g溶解在pH6.0的磷酸缓冲液配成100ml1000单位/ml的青霉素标准工作液.按下表加入青霉素标准溶液1mg青霉素G钠盐定为1667单位1000/1667mg=0.6mg1000单位100ml1000单位/ml100*0.6mg=0.06g称取0.06g苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液不同浓度青霉素标品溶液的配制试管号青霉素浓度(单位/ml)1000单位/ml青霉素溶液(ml)pH6.0磷酸缓冲液(ml)1100192200283300374400465500554.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备将37℃培养16-18h的斜面菌种用0.85%的生理盐水洗下离心沉淀(3000rpm*5min)倾去