实验一 制霉菌素发酵、提取与效价测定.pdf

实验一制霉菌素发酵、提取与效价测定1.实验目的与要求(1)了解抗生素发酵的一般过程及发酵过程中一些重要理化指标检测方法；(2)学习抗生素（制霉菌素）的提取纯化工艺；(3)了解制霉菌素化学效价测定的原理；(4)掌握抗生素生物效价测定的常规方法——管碟法的原理与操作。2.实验原理2.1制霉菌素制霉菌素(nystatin,mycostatinorfungicidin)是由诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei)产生的一种多烯大环内酯类(polyenemacrolides)抗真菌抗生素。此类抗生素的结构特点是在分子中既有经内酯化作用而闭合的大碳环，又有一系列的共轭双键。制霉菌素存在于菌丝体中，其纯品为淡黄色微细晶体；不溶于水、氯仿和丙酮等；稍溶于低级醇等；溶于吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破坏而失效；对较高和较低的pH以及光和热均不稳定。临床上使用的制霉菌素，其主要成分为制霉菌素A1，化学结构式如下图所示：它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3-氨基-3,6-二脱氧-D-吡喃甘露糖，非糖部分为38员的多烯大环内酯。制霉菌素对各种真菌如白色念珠菌、隐球菌、荚膜组织胞浆菌及球孢子菌等有抑制作用。主要用于白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鹅口疮、念珠菌性阴道炎及外阴炎等。但口服治疗全身性真菌感染或深部真菌感染则无效。制霉菌素的作用机理是与真菌细胞膜上的特异甾醇相结合，导致原生质膜破坏，通透性改变，以致重要的细胞内容物外漏而死亡，从而杀灭真菌。由于细菌原生质膜上不含甾醇，故本品对细菌无效；对肠道正常菌丛也无作用。2.2抗生素发酵生产工艺简介抗生素液体发酵共分为三大工序：菌种、发酵和提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。具体而言，其过程为菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取与精制→成品包装。菌种一般采用液氮超低温保藏或沙土管保藏。一般生产用菌种经多次转接往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化，以提高其生产能力。生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，经过严格的无菌程续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定条件下培养至孢子量符合生产需要，必要时可用大茄子瓶在固体培养基上扩大培养。种子制备的目的是使孢子发芽、繁殖，以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中。种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养；或直接将孢子接入种子罐后就、逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。发酵接种量一般为10%或10%以上，发酵周期视抗生素品种和发酵工艺而定。发酵期间，每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌检验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。发酵液的过滤和预处理的目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量存在于菌丝之中，在此情况下，发酵液预处理目的包括使抗生素从菌丝中析出转入发酵液或使菌丝体与发酵液分离。提取的目的是从发酵液（和/或菌丝体）中制取高纯度的、符合药典规定的抗生素成品。在发酵液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对较高。杂质中含有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热源质或有毒性物质等。此外还可能有一些杂质，其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：时间短、温度低、pH宜选择对抗生素较稳定的范围、勤清洗消毒。目前常用的抗生素提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。精制是抗生素生产的最后步骤，对产品精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”（即GMP）的规定。抗生素精制可选用的步骤有：脱色和去热源质、结晶和重结晶、共沸蒸馏法、柱层析法、盐析法、中间盐转移法和分子筛等。2.3抗生素的效价与测定通常用效价来衡量抗生素发酵液中抗生素含量。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。生物效价测定法有稀释法、比浊法和扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种，是最常用的测定抗生素效价的方法。据此，效价即可视为用抗菌效力表示的抗生素的有效含量。管碟法就是在接种有敏感实验菌的琼脂平板上放上牛津杯，然后向杯内加满抗生素溶液，保温培养一定时间后，抗生素渗透到一定的范围，抑制敏感菌的生长，产生透明圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量（单位）、抗生素的扩散系数（cm2/h）、扩散时间（即抗生素溶液注入牛津杯至出现抑菌圈所需的时间）、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(U/mL)等有关