用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113981107A(43)申请公布日2022.01.28(21)申请号202111353738.2(22)申请日2021.11.16(71)申请人中国水产科学研究院南海水产研究所地址510000广东省广州市海珠区新港西路231号(72)发明人秦传新孙美婧郭禹(74)专利代理机构深圳市创富知识产权代理有限公司44367代理人高冰(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页(54)发明名称用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用(57)摘要本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用，针对目前对于岩礁性鱼类eDNA的研究较少，本发明在不破坏生态环境的前提下通过采集黄鳍棘鲷生活水域的水样，运用分子技术进行检测，设计可以验证黄鳍棘鲷这一目标物种的荧光引物和Taqman探针，并最终确定了特异性强、敏感性高的COI基因的引物组合(特异性引物对和探针)，通过绝对定量，建立目标物种浓度与Ct值之间的关系，得到两者的标准曲线，本发明的引物组合可以用于鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷，并可确定水样中黄鳍棘鲷的浓度，对于通过环境DNA检测开展黄鳍棘鲷的资源保护具有非常重要的意义。CN113981107ACN113981107A权利要求书1/1页1.用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异引物和探针，所述特异引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，所述探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO：13所示。2.权利要求1所述的引物组合在检测黄鳍棘鲷环境DNA中的应用。3.一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异引物。4.一种用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的荧光定量试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。5.一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，其特征在于，用权利要求1所述的特异引物对黄鳍棘鲷生活环境的DNA进行PCR检测，通过检测条带的有无确定鉴定水样中是否存在目标物种黄鳍棘鲷。6.根据权利要求5所述的一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，其特征在于，PCR检测采用50μL体系，包括2×TaqMix25μL，小于500ng的DNA模板1‑5μL，PrimerF1μL，PrimerR1μL，加无菌水至50μL。7.根据权利要求5所述的一种通过eDNA技术检测黄鳍棘鲷的方法，其特征在于，PCR检测的反应程序采用3步法，具体设置如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；(3)72℃再延伸5min。8.一种适合黄鳍棘鲷eDNA的PCR荧光定量方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物组合对黄鳍棘鲷生活环境的DNA进行荧光定量PCR，并绘制黄鳍棘鲷COⅠ基因质粒标准品浓度与Ct值之间的标准曲线，最后根据标准曲线确定黄鳍棘鲷环境DNA的浓度。9.根据权利要求8所述的一种适合黄鳍棘鲷eDNA的PCR荧光定量方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系采用20μL体系，包括2×qPCRMix10μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，探针0.4μL，模板DNA2μL，PCR水6.8μL。10.根据权利要求8所述的一种适合黄鳍棘鲷eDNA的PCR荧光定量方法，其特征在于，荧光定量PCR的扩增反应程序采用两步法，具体设置如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性5s，60℃退火延伸30s，40个循环。2CN113981107A说明书1/8页用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于检测黄鳍棘鲷环境DNA的引物组合及其应用。背景技术[0002]黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)隶属于鱼纲Pisces、鲈形目Perciformes、鲷科Sparidae、棘鲷属Acanthopagrus，广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸和中国台湾、福建、广东、广西沿海。[0003]黄鳍棘鲷生活于近岸海域及河口湾，杂食性，其肉质鲜嫩、营养丰富，是一种重要的经济鱼类。作为一种岩礁性鱼类，黄鳍棘鲷没有远距离的洄游习性，但有明显的生殖迁移行为。黄鳍棘鲷养殖周期偏长，需一年半至两年才能达到5两左右的上市规格，极大限制了渔民的养殖该品种的热情。近年来，由于环境污染、过度捕捞等导致黄鳍棘鲷自然种群严重衰退，种质严重退化等。因此黃鳍棘鲷的资源保护具有重要的意义。而及时掌握黄鳍棘鲷种群的分布格局