一种AAV滴度的检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114959118A(43)申请公布日2022.08.30(21)申请号202210656805.6(22)申请日2022.06.11(71)申请人上海鼎新基因科技有限公司地址200131上海市浦东新区中国（上海）自由贸易试验区巴圣路160号7幢5单元2层2001室(72)发明人郑竹霞(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6806(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图7页(54)发明名称一种AAV滴度的检测方法(57)摘要本发明属于基因治疗领域，应用于腺相关病毒（AAV）生产过程中及最终纯化成品AAV病毒的滴度测定。通过本项目的优化能够开发一种特异性好并且准确可靠的AAV滴度检测方法，用于AAV生产过程中细胞内AAV和纯化AAV的基因组滴度测定。CN114959118ACN114959118A权利要求书1/1页1.一种AAV基因组滴度的检测方法，其特征在于样品经特定处理后，用qPCR方法进行测定。2.如权利要求1所述的方法，样品经核酸酶和蛋白酶K消化处理。3.如权利要求2所述的核酸酶为DNaseI酶和Benzonuclease酶。4.如权利要求2所述的蛋白酶K消化缓冲液为ddH2O和30mMTris‑HCl。5.如权利要求1所述的qPCR体系可用基因特异性引物和通用引物。6.如权利要求1‑5所述的检测方法适用于AAV生产过程中细胞内AAV和纯化AAV的基因组滴度测定。2CN114959118A说明书1/4页一种AAV滴度的检测方法技术领域[0001]本发明属于基因治疗领域，应用于腺相关病毒（AAV）生产过程中及最终纯化成品AAV病毒的滴度测定。背景技术[0002]重组腺相关病毒由于它的安全性和有效性，现已经成为基因治疗的常用载体，2012年第一个用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病（LPLD）的基因治疗药物Glybera在欧洲上市，2017年用于治疗由于RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病（IRD）的基因治疗药物voretigeneneparvovec‑rzyl在美国批准上市，次年在欧盟获批上市。目前有很多针对神经系统疾病和眼科疾病的重组AAV基因治疗药物正在临床前研究当中，2021年AGTC与Biogen宣布合作开始基因治疗XLRP的I/II期临床试验，该疗法使用新型重组AAV载体(rAAV2tYF‑GRK1‑RPGR)递送RPGR载体，用于治疗由RPGR基因突变导致视网膜色素变性而致盲。RegenXBio公司使用AAV8递送抗VEGF的Fab抗体，用于治疗湿性AMD，该药物目前处于Ⅲ期临床阶段。ADVERUM公司使用AAV7m8递送抗VEGF的蛋白用于治疗湿性AMD，并在2021年开始临床实验。Amicus公司目前有9个临床和临床前AAV药物用于治疗遗传性神经系统疾病。发明内容[0003]本发明针对包装细胞中AAV的定量优选地使用含Tx‑100的低渗PBS缓冲液裂解细胞，整个裂解过程快捷方便，细胞裂解充分，使得检测结果稳定。[0004]优选地自配制裂解液包含裂解液1：1%Tx‑100in0.25xPBS；优选地自配制裂解液包含裂解液2：50mMTris‑HCl，2mMMgCl2，200mMNaCl，1%(w/v)吐温80，pH8.0；优选地，商品化细胞裂解液为Takara细胞裂解液solutionA和solutionB。[0005]又一方面本发明针对包装细胞中AAV的定量以及病毒纯化过程中中间样品的AAV的定量，优选地使用核酸消化能力强且对待消化体系成分要求不高的Benzonuclease酶，以彻底消除残留转染质粒对滴度测定的影响。优选地Benzonuclease酶消化体系中含2mMMgCl2；又一方面本发明优化了蛋白酶K消化缓冲液成分，使得复杂成分中的AAV裂解更为充分，让测定结果更为准确。[0006]优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PKbuffer1为ddH2O;优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PKbuffer2为30mMTris‑HCl;优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PKbuffer3为10mMTris‑HCl,25mMEDTA,100mMNaCl,0.5%SDS;优选的蛋白酶K消化缓冲液成分PKbuffer4为10mMTris‑HCl,100mMEDTA,0.5%SDS。[0007]又一方面本发明针对纯化的AAV的定量使用DNaseI消化，使用线性化的质粒样品3CN114959118A说明书2/4页作为定量标准品，为了定量的批间稳定性，标准品以较低浓度（标曲定量最上线的10倍浓度）批量分装于特定的储存液中，置于‑80℃保存防止样品降解。[0008]又一方面本