基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114958988A(43)申请公布日2022.08.30(21)申请号202110221469.8(22)申请日2021.02.27(71)申请人上海境象生物科技有限公司地址201404上海市奉贤区金汇镇金斗路399号6幢(72)发明人雷向东(74)专利代理机构北京卓恒知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11394专利代理师唐曙晖(51)Int.Cl.C12Q1/686(2018.01)权利要求书2页说明书16页序列表5页附图5页(54)发明名称基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法和试剂盒(57)摘要本发明涉及一种基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤A：不对称PCR体系设计；步骤B：PCR扩增；步骤C：熔解曲线分析。本发明解决了传统的Taqman技术不能在扩增后进行熔解曲线分析以进一步判断探针区域序列是否与目标序列完全一致的重要问题，本发明能够在PCR扩增后进行熔解曲线分析，并且可以提升荧光PCR的检测多重度，同时还能进行基因分型和定量。CN114958988ACN114958988A权利要求书1/2页1.一种基于探针熔解曲线分析的多重核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：步骤A：不对称PCR体系设计；步骤B：PCR扩增；步骤C：熔解曲线分析；所述步骤A的不对称PCR体系设计包括：A1.针对每个目标核酸序列设计正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列设计简并引物，或设计多条引物；A2.对每个目标核酸序列设计一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间；其中A1中正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中低温引物浓度高于高温引物；A2中探针和高温引物与目标序列的同一条链杂交。2.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，A1中，高温和低温引物的Tm值相差0.1‑15℃，优选高温引物和低温引物Tm值相差3‑10℃；低Tm引物浓度与高Tm引物浓度的比值为1.05至30，优选的，1.3至25；A2中，探针Tm范围在40‑80℃；同一通道相邻的Tm值的差值在2‑35℃，优选探针Tm值两两之间相差2.5‑16℃。3.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，所述方法用于1‑3个核苷酸突变、插入或缺失的核酸检测，对每个目标突变位点的野生型和突变型仅设计一条探针；设计的探针在与野生型目标序列和突变的目标序列分别结合，野生型目标序列和突变的目标序列与探针分别结合的Tm值相差2‑30℃；或所述的方法用于≥3个碱基差别的核酸检测，其中对野生型序列和突变序列分别设计探针，分别设计的探针Tm值相差2‑30℃。4.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是：探针标记有荧光发色基团和荧光淬灭基团，荧光发色基团和淬灭基团标记在探针的两端或非两端位置。5.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，步骤B中，用于PCR扩增的DNA聚合酶是无5’‑>3’外切酶活力的聚合酶，或有5’‑>3’外切酶活力的聚合酶，或两者的混合物；优选地，当PCR扩增采用具有5’‑>3’外切酶活力的聚合酶时，探针的浓度至少不能低于高温引物的浓度。6.根据权利要求5所述的多重核酸检测方法，其特征是，针对需要进行定量检测的目标序列的检测探针，其Tm值至少不能低于PCR退火步骤的温度。7.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，在熔解曲线分析步骤C时，在PCR扩增步骤结束后在进行从低温到高温的熔解曲线分析前，包括一个缓慢的从高温到低温的DNA从单链形成双链的复性步骤，降温速度低于8℃/秒，优选的低于3℃/秒，更优选的低于2℃/秒；或分阶段降温，94℃至80℃，常规快速降温，从80℃至45℃进行缓慢降温。8.根据权利要求1所述的多重核酸检测方法，其特征是，可用于对多个目标序列进行多重检测，或对一个目标序列进行单重检测。9.根据权利要求1所述的方法，其特征是：使用辅助序列，所述辅助序列为长度5‑200个碱基的序列，且辅助序列与检测探针在与PCR产物杂交区域不重叠，优选地，所述辅助序列3’端进行修饰以阻止其被延长。10.一种基于探针熔解曲线分析的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：2CN114958988A权利要求书2/2页针对每个目标核酸序列设计的正向和反向PCR引物，每个目标序列设计至少一对引物，针对多个目标核酸序列可以设计简并引物，或设计多条引物；针对每个目标核酸序列设计的一条探针，探针设计位置位于正向和反向引物之间，针对不同目标序列的探针Tm值不同；以及用于PCR扩增的dNTP和DNA聚合酶、镁离子等常规组分；其中正向和反向引物的Tm值不同，引物在PCR扩增体系中Tm值低的引物浓度高于Tm值高的引物；探针和Tm值高的引物与目标序列的同一