利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113846187A(43)申请公布日2021.12.28(21)申请号202111237062.0(22)申请日2021.10.24(71)申请人北京宏微特斯生物科技有限公司地址101599北京市密云区滨河路178号院1号楼5层518-3申请人江苏宏微特斯医药科技有限公司(72)发明人刘利成唐奇王华贵冯华华胡小许(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书3页说明书10页序列表5页附图5页(54)发明名称利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒(57)摘要本发明提供利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。该方法包所述方法包括针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分。本发明通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。CN113846187ACN113846187A权利要求书1/3页1.利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异，且该差异可被检测仪器所区分；所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧，所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针‑模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA‑RNA杂交链；步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割探针与模板形成的DNA‑RNA杂交链中的RNA碱基，同时探针的5’端在核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用下被切割，使得探针中RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段与所述RNA碱基左侧的含有淬灭基团片段分离；步骤4：所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段由于含有硫代磷酸化修饰碱基，不会被核酸聚合酶的5’－3’外切酶作用切割，使得RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段在与靶标核酸结合后，仍能被保留；同时所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的片段的3’端标记封闭基团，使其不会在核酸聚合酶的作用下延伸；步骤5：通过不同待测目标核酸序列的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测和/或靶标核酸序列中的SNP的检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述RNA碱基右侧相隔一个碱基后连接3个连续的硫代磷酸化修饰碱基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针中包含一个RNA碱基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述探针RNA碱基左侧片段的5’端第1个碱基与从5’端开始的2～5bp的任一个碱基上分别标记猝灭基团。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针上标记的荧光基团和非末端淬灭基团的碱基之间距离为5‑15bp。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中聚合酶为具有5’—3’外切酶活性的Taq酶。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐热核糖核酸酶RNaseH包括RNaseH2。8.利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的探针，其特征在于，所述探针含至少一个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团，在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团，在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少2个连续的硫代磷酸化修饰碱基，所述硫代磷