一种人类粪便DNA提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102864138A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102864138A(43)申请公布日2013.01.09(21)申请号201210320895.8(22)申请日2012.09.03(71)申请人浙江世纪康大医疗科技有限公司地址311215浙江省杭州市萧山区建设四路99号(72)发明人秦炜毕婷婷阮丽娟陈标榜余向东(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人杜军(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书66页页(54)发明名称一种人类粪便DNA提取方法(57)摘要本发明公开了一种人类粪便DNA提取方法。现有技术很繁琐而且耗时，且过去采样的方法抽提出的痕量DNA由于含量太少，很难用来进行分子诊断。本发明对粪便样品采用选择性样品采集PSC，采用低温保存法，然后用灭菌枪头或灭菌刀片挑取样本，直接置于冰上；首先加入粪便裂解液，充分裂解混匀后加入牛血清白蛋白，离心去上清液加入蛋白酶K置于58℃条件下消化反应，然后加入蛋白沉淀液沉淀蛋白，离心取上清液加入硅胶膜结合液充分结合DNA，离心取沉淀物加入硅胶膜洗涤液洗涤两次，离心后加入TE缓冲液，最后得到含DNA的保存液。本发明具有较高的重复稳定性、较简单且不耗时的优点。CN1028643ACN102864138A权利要求书1/1页1.一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤一.粪便样品的采集：采集人排出的暴露不超过24小时的粪便样品，采用选择性样品采集，用无菌刀片刮下粪便样品的表层黏膜，分装到2ml离心管中；步骤二.粪便样品的保存：采用低温保存法，采集来的粪便样品，立即放于-20℃～-80℃保存；步骤三.粪便样品的取样：对于所保存的粪便样品，拿出置于冰上，用灭菌枪头或灭菌刀片挑取180～200mg的样本，置于冰上；步骤四.样本的DNA提取：(1).细胞裂解分离在样本中加入1.2～1.6ml的粪便裂解液，置于常温条件下充分裂解混匀后离心分离，取上清液，加入200～300mg牛血清白蛋白BSA去除杂质，离心分离得到上清液，在该上清液中加入20～40μl的浓度为20mg/ml的蛋白酶K置于58℃条件下消化反应1～6h，得到消化液；所述的粪便裂解液由50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA、1mmol/LNaCl和重量体积比为0.1%十二烷基硫酸钠SDS配制而成；(2).沉淀将上述步骤(1)所得的消化液冰浴冷却至常温，再加入200～400μl蛋白沉淀液沉淀蛋白，充分混匀后经离心分离去除蛋白杂质，得到离心后的上清液，该上清液为DNA抽提液；(3).纯化向已经去除蛋白杂质的DNA抽提液中加入硅胶膜结合液，DNA抽提液与硅胶膜结合液的体积比为1:1.5～1:2.5，然后经硅胶膜吸附，离心分离，得到沉淀物，在沉淀物中加入700～800μl硅胶膜洗涤液洗涤，重复洗涤两次，然后离心分离脱去硅胶膜中残存的硅胶膜洗涤液后，加入50～100μlTE缓冲液溶解洗脱DNA，离心分离得到离心后的上清液，该上清液为含DNA的保存液。2.根据权利要求1所述的一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于：DNA的提取无需经过磷酸盐缓冲液或者生理盐水浸泡、洗涤这些预处理过程，可直接迅速取180～200mg人的粪便样本置于冰上，进行DNA提取。3.根据权利要求1所述的一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于：所述的硅胶膜结合液为3mol/L盐酸胍。4.根据权利要求1所述的一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于：所述的硅胶膜洗涤液由2mmol/LTris-Cl、1mmol/LEDTA、5mmol/LNaCl和体积含量为50%的乙醇配制而成。5.根据权利要求1所述的一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于：所述的蛋白沉淀液由2mol/L乙酸钾和体积含量为11.5%冰乙酸配制而成。2CN102864138A说明书1/6页一种人类粪便DNA提取方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种人类粪便DNA提取方法。背景技术[0002]结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌。近二十年来结直肠癌的发病率在逐渐增加，同时，其发病年龄趋向老龄化。在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。近年来的一些研究表明K-ras，P53，APC，MMR等一些基因的突变会导致正常结肠黏膜上皮细胞转化成肿瘤细胞（Vogelstein，B.andKinzler，K.W.，1993），对这些基因突变的研究进展，使得通过粪便DNA检测诊断结直肠癌成为一种可能。正常人的粪便每天大约可排泄接近1010个上皮细胞，对脱落到粪便里的结肠黏膜细